The APICULTURAL SOCIETY OF KOREA
1

Current Issue

Journal of Apiculture - Vol. 33 , No. 1

[ Article ]
Journal of Apiculture - Vol. 33, No. 1, pp.9-16
Abbreviation: J. Apic.
ISSN: 1225-0252 (Print)
Print publication date 30 Apr 2018
Received 15 Jan 2018 Revised 14 Apr 2018 Accepted 24 Apr 2018
DOI: https://doi.org/10.17519/apiculture.2018.04.33.1.9

Bacillus cereus, Streptococcus agalactiaePseudomonas aeruginosa에 대한 정제봉독의 항균효과
한상미* ; 우순옥 ; 김세건 ; 장혜리 ; 이경우1
농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부
1건국대학교 동물자원과학과

Antibacterial Effects of Purified Bee Venom against Bacillus cereus, Streptococcus agalactiae, and Pseudomonas aeruginosa
Sang Mi Han* ; Soon Ok Woo ; Se Gun Kim ; Hye Ri Jang ; Kyung Woo Lee1
Department of Agricultural Biology, National Institute of Agricultural Science, Rural Development Administration, Wanju 55365, Korea
1Department of Animal Science and Technology, Konkuk University, Seoul 05029, Korea
Correspondence to : *E-mail: sangmih@korea.kr

Funding Information ▼

초록

사람과 가축에 모두 질병을 유발할 수 있는 감염세균인 B. cereus, S. agalactiae 그리고 P. aeruginosa에 대한 정제봉독의 항균효과를 검정한 결과, 최소성장억제농도는 각각 1.835±0.202, 0.54±0.32 그리고 0.056±0.01μg/mL로 매우 높은 항균력이 확인되었다. 최소살균농도 역시 B. cereus, S. agalactiae 그리고 P. aeruginosa 균에 대해 각각 33.9±1.23, 4.08±0.3과 0.59±0279μg/mL로 높은 살균력을 갖고 있었다. S. agalactiae 그리고 P. aeruginosa 세균은 10×MIC 농도의 정제봉독을 처리한 경우에 4시간 배양만으로도 충분히 균의 생장이 유의적으로 저해되었으며, P. aeruginosa 균은 1× MIC 농도에서도 균의 생장이 저해되었다. 정제봉독의 항균력 지속시간은 B. cereus는 1.5시간, S. agalactiae은 1.5시간, 그리고 P. aeruginosa 세균에서는 5.5시간이였다. 따라서 정제봉독은 기존의 항생제에 대한 내성 출현이 빈번한 B. cereus, S. agalactiae 그리고 P. aeruginosa에 대해 높은 항균력과 항균력 지속시간을 갖고 있는 것으로 확인되어 천연항생제로서 사료 첨가제로 이용 가능성이 높은 것으로 사료되었다.

Abstract

Bacillus cereus, Streptococcus agalactiae and Pseudomonas aeruginosa can cause disease in plants and animals, including humans. A species of considerable medical importance, they are a multidrug resistant pathogen recognised for their ubiquity, its intrinsically advanced antibiotic resistance mechanisms, and its association with serious illnesses - hospital-acquired infections such as ventilator-associated pneumonia and various sepsis syndromes. B. cereus, S. agalactiae and P. aeruginosa were tested for antibacterial effects to purified bee venom (Apis mellifera L.). We evaluated the antibacterial effect of purified bee venom by minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC), time-kill assay and postantibiotic effect (PAE). Purified bee venom exhibited significant inhibition of bacterial growth of B. cereus, S. agalactiae and P. aeruginosa with MIC value of 1.835±0.202, 0.54±0.32 and 0.056±0.01μg/ml, respectively. The MBC value of purified bee venom against B. cereus, S. agalactiae and P. aeruginosa were 33.9± 1.23, 4.08±0.3 and 0.59±0279μg/ml. In the presence of 2×MIC concentrations of the purified bee venom, indicating that growth of all bacteria was also significantly inhibited within 4 hours. Furthermore, the results of PAE values against B. cereus, S. agalactiae and P. aeruginosa showed the bacterial effect with 1.5, 1.5 and 5.5 hr. In this suty, these results were suggested that purified bee venom might be utilized as a natural antibiotic agents in animal diets.


Keywords: Apis mellifera, Purified bee venom, Bacillus cereus, Streptococcus agalactiae, Pseudomonas aeruginosa, MIC, MBC

서 론

생활수준의 향상과 건강에 대한 관심 증대로 안전한 먹거리에 대한 요구도가 높아지고 있는 추세이다. 농축산물의 안전성을 위협하는 식중독 사고의 원인이 되는 병원성 미생물 오염은 생산단계에서 유통과정에 이르는 전 단계에서 일어날 수 있으며, 특히 이러한 오염원과 오염 과정 중에 발생하는 독소 등에 의해 식중독, 패혈증 등이 유발될 수 있다(FDA, 2005). 농축산물에서 빈번하게 검출되는 토양 유래 세균인 Bacillus cereus는 구토나 설사를 일으키는 독소형 식중독 세균으로 알려져 있으며 주로 육류나 소시지가 원인 식품이다(Kramer et al., 1989; Phelps and McKillip, 2002).

B. cereus에 의한 설사형 식중독은 B. cereus가 소장에서 증식하는 동안 생성되는 장독소(enterotoxin)로 인해 유발된다(Kim et al., 2006). 또한 구토형 식중독은 emetic toxin에 의해 유발되는 식중독으로 가열하여도 파괴되지 않는 열 저항성과 산, 알칼리, 단백질 가수분해효소에도 저항성을 가지고 있다(Hansen et al., 2001). Streptococcus agalactiae는 젖소 질병 중 가장 많이 발생하는 유방염의 원인균이며, 신생아 폐렴, 패혈증과 같은 신생아 감염의 주요 원인균으로 알려져있다(Farley, 2001). 특히 젖소 유방염은 우유 중에 체세포수가 증가하여 유질이 저하되고 유량이 감소, 치료비 지출 등 경제적 손실이 매우 큰 질병 중에 하나이다(Lee et al., 2007). Pseudomonas aeruginosa은 패혈증, 전신감염, 만성기도 감염증 및 췌낭포성 섬유증 환자에게 난치성 감염을 일으키는 병원균이다(Cryz Jr, 1984). 수술이나 화상, 외상 등 저항력이 저하된 환자가 P. aeruginosa에 감염되어 패혈증에 걸리면 고열과 혈압저하 등 쇼크를 일으켜 결국 사망에까지 이르게 된다(Cryz Jr, 1984; Chamberland et al., 1992). 최근 우리나라에서 입원 치료 중인 개와 고양이로부터 항생제 내성 유전자를 보유하고 있는 P. aeruginosa를 검출하였다고 보고된 바 있다(Cho et al., 2013).

본 연구에서는 순수 천연물질이면서 강력한 항균, 항염증 및 면역증강 등의 효과를 갖는 봉독을 이용하여 사람과 가축 모두에 질병을 유발하는 병원균에 항균효과를 갖고 있는지를 알아보고자 하였다. 서양종 꿀벌(Apis mellifera L.) 일벌의 독인 봉독은 다양한 성분이 복합적으로 구성되어 있으며, 주 성분인 멜리틴(melittin)은 항염증과 항균작용, 강력한 진통작용, 면역증강 등의 역할을 한다고 알려져 있다(Habermann and Reiz, 1965; Fennelle et al., 1967; Piek, 1986). 본 연구팀에서는 2005년 봉독채집장치와 채집된 봉독으로부터 이물질을 제거할 수 있는 봉독정제법을 개발하였고(한 등, 2007). 정제봉독이 폐사한 육계로부터 분리한 Clostridium perfringens, Salmonella typhimurium 그리고 Salmonella montevideo에 대해 높은 항균력을 갖고 있음을 확인하였다(Han et al., 2016). 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 등 유방염 원인균에 의해 유발된 젖소 유방염의 경우 봉독 투여로 체세포수가 크게 감소하였으며, 유방염에 감염된 젖소로부터 채취한 원유에서 분리한 균에 대한 항균력이 우수한 것으로 보고된 바 있다(Han et al., 2007). 또한 봉독을 자돈 및 양계에 처리했을 때 체중 및 생존율 증가와 같은 생산성 향상과 질병 감소에 효과를 나타내었다(Han et al., 2009; Han et al., 2010a). 뿐만 아니라 봉독을 분만 전 교소혈(交巢穴)에 투여한 경우 분만 소요시간 단축과 후산 정체율 감소 등 분만효율이 개선되었으며, 발정 재귀일수와 분만간격의 단축과 봉독을 투여한 어미소로부터 출생한 신생송아지의 체중 증가와 질병이 감소하는 것으로 보고되었다(Han et al., 2010b).

따라서 본 연구에서는 사람과 가축에게 질병을 유발하며 기존의 항생제에 내성이 높은 세균에 대한 봉독의 항균력을 측정하여 사료 내 항생제 대체제로서의 가능성을 검증하고자 하였다.


재료 및 방법
봉독 시료

봉독은 서양종 꿀벌에 봉독 채집장치(청진테크, 한국)를 이용하여 채취 분리한 다음 간이정제방법으로(한 등, 2007) 정제한 정제봉독(한국정제봉독협동조합, 한국)을 구입하여 UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography, Waters, USA)를 이용하여 주요성분 함량을 분석 후 실험에 사용하였다(Table 1, Han et al., 2016). 시험에 사용한 정제봉독의 멜리틴, 포스포리파아제 그리고 아파민의 함량은 각각 63.6%, 10.9%, 2.3%였다.

Table 1. 
Conditions for Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) analysis of purified bee venom
Items Conditions
Column Halo ES-18 (4.6×100mm, 2.7um)
Flow rate 1.5mL/min
Injection volume 4μL
Column temperature 50°C
Sample temperature 5°C
Mobil phase Time (min) A1) (%) B2) (%)
0 10 90
3 31 69
5 40 60
10 45 55
1)A is 20mM TFA/MeCN
2)B is 20mM TFA/H2O

공시균주 및 배양 조건

시험에 사용한 균주는 건국대학교로부터 B. cereus (ATCC 11778), S. agalactiae (ATCC 13813) 그리고 P. aeruginosa (ATCC 15442)를 분양받아 사용하였다. B. cereus는 NB (Nutrient broth, BD Difco, USA) 배지에, S. agalactiae는 5% sheep blood (MD cell, USA)를 포함한 TSA (Trypticase soy agar, BD Difco, USA)배지에 그리고 P. aeruginosa는 TSA 배지를 사용하여 37°C에서 배양하여 실험 전까지 2회 계대배양 후 실험에 사용하였다.

최소생장억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)와 최소살균농도(Minimum Bactericidal Concentration, MBC) 측정

액체배지 희석법을 사용하여 B. cereus, S. agalactiae 그리고 P. aeruginosa 세균에 대한 최저생장억제농도를 구하였다(CLSI, 2012). 정제봉독은 멸균 증류수로 희석한 후 무균 여과하여 액체배지희석법에 준하여 단계적으로 희석하였다(Wu와 Hancock, 1999). 각각의 시험균주를 액체배지에서 전 배양한 후 접종 균의 2×106 CFU/well이 되도록 조절하여 봉독 시료와 함께 18시간 동안 배양한 후, 육안 및 현미경으로 균의 성장을 관찰하였고, 흡수파장 625nm에서 흡광도(Molecular device spectramax M2e, CA)를 측정하여 순수배양액의 흡광도 값과 같은 결과를 얻은 것을 최소억제농도로 결정하였다(NCCLS, 2008). 정제봉독의 최소살균농도값은 각각의 시험균주에서 사용하는 액체배지로 희석한 후 액체배지희석법에 따라 단계적으로 희석 한 후 2×106 CFU/well이 되도록 조절한 각각의 균주에 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 각각의 배양액 100μL를 새로운 배지에 접종하여 24시간 동안 배양한 다음 흡광도(625nm)를 측정하여 증식이 일어나지 않은 농도를 최소살균농도로 나타내었다(NCCLS, 2008).

생육저해 효과(Time-kill assay)

시험균주에 대한 정제봉독의 살균력 지속시간을 측정하기 위하여 1×108 CFU/mL 조절한 균주에 각각 MIC, 2×MIC, 그리고 10×MIC값 농도의 정제봉독과 함께 37°C로 배양하였다. 배양 후 4시간 간격으로 0.5mL을 취하여 4.5mL의 새로운 액체배지와 함께 37°C에서 배양하였다. 각각 24시간 배양 후 평판배지에 접종하여 균수를 측정하였다(Schwalbe et al., 2007).

항균력 지속 시간(Postantibiotic effect, PAE) 측정

시험균주에 대한 정제봉독의 살균력 지속시간을 측정하기 위하여 1×108 CFU/mL로 조절한 균주에 2×MIC값 농도의 정제봉독과 함께 1시간동안 배양한 후 원심분리와 배지 희석법을 사용하여 봉독성분을 제거하였다(Löwdin et al., 1993). 이후 새로운 배지로 교환하여 배양기에서 배양하면서 2시간 간격으로 균수를 측정하였다. 이때 PAE 수치가 클수록 항균 지속효과가 우수하다고 할 수 있으며, PAE를 구하는 식은 아래와 같다.

  • PAE=T-C
  • T : 봉독을 처리한 시험구에서 1 log10까지의 생육에 걸리는 시간
  • C : 무처리구에서 1 log10까지의 생육에 걸리는 시간
통계처리

실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 R 통계프로그램을 이용하여 분석하였으며, 그 결과는 평균±표준오차(mean±SEM)로 표시하였다.


결 과
정제봉독의 최소생장억제 농도와 최소살균농도

B. cereus, S. agalactiae 그리고 P. aeruginosa에 대한 정제봉독의 최소성장억제농도는 각각 1.835±0.202, 0.54±0.32 그리고 0.056±0.01μg/mL로 매우 높은 항균력이 확인되었다(Table 2). 최소살균농도 역시 B. cereus, S. agalactiae 그리고 P. aeruginosa 균에 대해 각각 33.9±1.23, 4.08±0.3과 0.59±0279μg/ml로 높은 살균력을 갖고 있었다(Table 2). 특히 녹농균인 P. aeruginosa는 정제봉독에 대해서 매우 높은 감수성을 보였다.

Table 2. 
MIC and MBC values of purified bee venom against Bacillus cereus, Streptococcus agalactiae and Pseudomonas aeruginosa
Bacteria Purified bee venom (Mean±SED, μg/mL)1)
MIC MBC
Bacillus cereus 1.84±0.201) 33.9±1.23
Streptococcus agalactiae 0.54±0.32 4.08±0.30
Pseudomonas aeruginosa 0.07±0.01 0.59±0.27
1)All values are Mean±SED of triplicate.

정제봉독의 생육저해 효과

B. cereus, S. agalactiae 그리고 P. aeruginosa 세균에 대한 1×MIC, 2×MIC 그리고 10×MIC의 정제봉독을 24시간동안 배양하면서 4시간 간격으로 24시간동안 각 세균의 생장에 미치는 영향을 시험한 결과, 모든 농도에서 균의 생장이 저해되는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 모든 균주에 대해 2×MIC 농도의 정제봉독을 처리한 경우에 4시간 배양만으로도 충분히 균의 생장이 유의적으로 저해되는 효과를 확인 할 수 있었다(p<0.001). S. agalactiae 그리고 P. aeruginosa 세균은 10×MIC 농도의 정제봉독을 처리한 경우에 4시간 배양만으로도 충분히 균의 생장이 완전히 저해되어 사멸하는 효과를 확인 할 수 있었다(p<0.0001). 봉독을 처리하지 않은 대조구에서는 4시간 이후 균의 생장이 급격히 증가하는 것으로 확인되었다. 특히 P. aeruginosa균에 대해서는 0.056±0.01μg/mL의 MIC 농도에서도 4시간이 경과했을 경우에도 균의 생장이 저해되어 사멸하는 것을 확인할 수 있었다.


Fig. 1. 
Ultra performance liquid chromatography spectrum of the purified bee venom.


Fig. 2. 
Time-kill assay of the purified bee venom against (A) Bacillus cereus, (B) Streptococcus agalactiae and (C) Pseudomonas aeruginosa. Data are represented as mean±SED of three experiments. *p<0.001, **p<0.0001.

정제봉독의 항균력 지속시간

B. cereus, S. agalactiae 그리고 P. aeruginosa 세균에 대한 정제봉독의 항균력 지속시간(PAE)을 측정하였다. 봉독 제거 후 2시간 간격으로 균수를 측정한 결과 Table 3과 같이 B. cereus에서는 1.5시간, S. agalactiae은 1.5 시간인 반면 P. aeruginosa 세균에서는 5.5시간으로 매우 우수한 항균력 지속시간을 갖고 있었다.

Table 3. 
PAE of purified bee venom against Bacillus cereus, Streptococcus agalactiae and Pseudomonas aeruginosa
Strains PAE (hr.)
Bacillus cereus 1.5
Streptococcus agalactiae 1.5
Pseudomonas aeruginosa 5.5


고 찰

가축과 반려동물은 오래전부터 사람과 밀접한 관계를 가져왔고, 축산물로부터 식중독을 유발한다던지 병원균에 감염된 개와 고양이들로부터 병원균이 사람에게 전파될 수 있어 공중보건학적으로 중요하다. 가축의 사육과정에서 사용되는 항생제로 인하여 축산물에서 분리된 균주들에서 항생제 내성균이 검출되어 감염증의 치료를 어렵게 할 뿐만 아니라 인수 공통 세균이 항생제 내성을 갖게 되어 사람에게 감염될 경우 심각한 문제를 초래할 수 있다. B. cereus는 그람양성세균이며 간균의 형태이고 편모를 가지고 있고, 내생포자는 중앙에 편재되어있는 통성혐기성균으로 penicillin에 내성이 있으며, 가장 흔한 감염은 식중독이나 전신성 감염을 비롯하여 드물게 창상, 화상, 혈액투석, 수혈, 척수 마취할 때 및 면역이 약한 사람에 게 감염을 일으킬 수도 있다(Lund, 1990; Drobniewski, 1993). B. cereus는 많은 단백분해효소를 생성하여, 사람과 기축에게 독성을 보이기 때문에 내성을 갖지 않는 항생제 치료가 중요하다. S. agalactiae는 catalase 음성 연쇄구균으로서 원래는 젖소 유방염의 원인균이었으며 사람의 감염은 1938년 산욕기 패열증 환자에서 최초로 보고되었다(Farley, 2001). 이후 오랫동안 S. agalactiae에 의한 인체 감염은 산발적인 증례 보고가 있었으나 임상적 의의는 불확실한 것으로 생각하였다. 그러나 1960년대 말부터 임신부와 신생아 감염 환자에서 이전보다 높은 분리율을 보였고 1970년대에는 신생아 패혈증과 뇌막염 환자에서의 분리율이 급격히 증가하였으며 동시에 임신부와 성인에서의 감염이 증가하기 시작하여 1990년대 이후로 임상 검체에서의 분리율이 증가하고 있으며 항균제 내성률 또한 높아지고 있는 것으로 보고되고 있다(Lee et al., 2013).

P. aeruginosa는 그람음성의 호기성 간균으로 병원에 입원한 환자들에게 균혈증을 유발하는 위험한 균이지만 그동안은 Taphylococcus aureus을 우선 원인균으로 지목하여 그 위험성이 간과되고 있었다(Cryz, 1984). 그러나 미국 대도시 병원의 균혈증 환자 중에서 녹농균 균혈증에 의한 사망률이 높다는 연구 결과뿐만 아니라 대부분 항생제에만 의존해 항생제 남용으로 내성 균주가 생겨 기존 상용 항생제에 의한 치료는 점점 어려워지고 있어 치료가 쉽지 않다는 점에서 우려되고 있는 상황이다(Hall과 Collis, 1998). 최근에는 녹농균이 요도 감염 및 콘택트렌즈 사용자의 각막궤양에서도 검출되고 있으며 녹농균에 의한 각막궤양이 발생하는 경우는 드물지만 일단 감염되면 실명에 이를 정도로 위험하다(Seo et al., 2016). P. aeruginosaβ-lactam 제제의 일부를 포함한 여러 항균제에 자연 내성이지만 ceftazidime와 piperacillin 그리고 ticarcillin 등에는 비교적 강한 항균력을 지닌다고 알려져 있었으나, 개에서 분리된 P. aeruginosa는 ampicillin, ceftazidime 그리고 sulfamethoxazole/trimethoprim에 대하여 높은 내성을 갖고 있으며, Rubin 등(2008)은 사용된 대부분의 항생제에 높은 내성을 보고하였다(Chamberland et al., 1992; Yoo et al., 2002; Cho et al., 2013).

봉독은 살아있는 벌을 이용한 봉침요법으로 오래전부터 인체 및 가축의 질병 치료에 사용되어 왔다. 최근 봉독채집장치의 개발과 봉독정제법이 개발됨에 따라 정제봉독은 화장품의 원료로 사용되고 있으며, 의약품과 동물용의약품, 사료첨가제 등으로 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 따라서 본 연구에서는 정제봉독을 사람과 가축 모두에 질병을 유발할 수 있는 B. cereus, S. agalactiae 그리고 P. aeruginosa에 대한 항균력을 측정하였다. 그 결과 최소생육억제농도는 B. cereus, S. agalactiae 그리고 P. aeruginosa에서 각각 1.835±0.202, 0.54±0.32 그리고 0.056±0.01μg/mL이였으며 최소살균농도 역시 각각 33.9±1.23, 4.08±0.3과 0.59±0279μg/mL로 매우 높은 항균력을 갖고 있었다. 특히 P. aeruginosa에 대해서는 매우 높은 감수성을 갖고 있는 것으로 확인되었다. B. cereus. S. agalactiaeP. aeruginosa 세균은 모두 정제봉독과 4시간 배양만으로도 충분히 균의 생장이 유의적으로 저해되는 효과를 확인 할 수 있었다(p<0.001). 정제봉독을 제거하고도 이 B. cereus에서는 1.5시간, S. agalactiae은 1.5시간인 반면 P. aeruginosa 세균에서는 5.5시간으로 매우 우수한 항균력 지속시간을 갖고 있었다.

이상의 연구 결과로 정제봉독은 기존의 항생제에 대한 내성이 우려되는 B. cereus, S. agalactiae 그리고 P. aeruginosa에 대한 높은 항균력과 살균력을 갖고 있음을 확인하였으며, 가축의 면역력 향상과 질병을 유발하는 병원성 세균에 대한 항균효과가 뛰어난 정제봉독을 이용하여 천연항생 기능을 갖는 사료 원료로의 가능성이 높은 것으로 사료되었다.


Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 차세대바이오그린21사업(과제번호: PJ01316602)에 의하여 수행되었습니다.


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