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시험에 사용된 토종꿀벌은 농촌진흥청 국립농업과학원에서 2009년부터 2017년까지 선발 육성된 낭충봉아부패병 저항성 신품종인 한라벌을 이용하였으며, 농가에서 구입한 비저항성 품종을 대조구로 사용하였다. 각각의 봉군은 국립농업과학원 실험양봉장에서 사육하면서 외형적 특성 및 형질특성을 분석하는데 이용하였다.

낭충봉아부패병 저항성 신품종 토종꿀벌인 한라벌의 외형적 특성 분석을 위하여 한라벌과 농가에서 사육 중인 토종꿀벌 각 4봉군에서 각각 60마리의 일벌을 채집하여 95% EtOH에 보관 후 외부 형질 부위별로 Leica MZ 16A (Leica application suite)을 이용하여 LAS program으로 측정하였다. 외부형질 특성 비교를 위하여 Ruttner (1988)에서 설명한 외부형질로 체장 (BL: body length), 배길이 (AL: abdominal length), 몸통 폭 (AW: abdominal width), 머리 길이 (HH: head height), 머리 폭 (HW: head width), 안테나 길이 (AL: antennal length), 앞날개 길이 (FWL: forewing length), 앞날개 폭 (FWW: forewing width), 뒷날개 길이 (HWL: hindwing length), 뒷날개 폭 (HWW: hindwing width), 날개 고리 수 (WH: wing-hooks), 허벅지 마디 길이 (FL: femur length), 뒷다리 종아리 마디 길이 (TL: tibia length), 화분받이 길이 (BL: basitarsus length), 화분받이 폭 (BW: basitarsus width)을 측정하였다.

신규육성 품종의 질병저항성 검증을 위한 방법으로 pin kill test 방법을 사용하였다. 시험을 위하여 낭충봉아부패병 저항성 신품종 토종꿀벌 (한라벌)과 농가 관행 사육 토종꿀벌은 각각 3봉군씩 3회 조사하였다. 시험용 봉군은 개량벌통에서 사육하는 토종꿀벌로 먹이장 1매, 산란 소비 3매로 구성된 봉군의 일벌 수를 동일한 수준으로 맞추어 시험하였다. Pin kill test는 100개의 봉개된 번데기 방을 핀으로 찔러서 죽인 후 24시간 경과 후 번데기 방을 완전히 청소한 비율을 측정하였다.

토종꿀벌 낭충봉아부패병 저항성 신품종 (한라벌)의 낭충봉아부패병에 대한 저항성 시험을 위하여 낭충봉아부패병 바이러스가 감염된 유충을 채집하여 낭충봉아부패병 바이러스 유전자의 정량 분석을 위하여 사료는 Trizol을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 시료를 액체질소로 동결 마쇄한 후 200 μL chloroform과 Trizol 1 mL을 100 mg의 시료와 섞은 후 15초간 vortex 하고 실온에 2∼3분간 반응하였다. 반응 후 시료를 12,000×g, 15분간 4℃ 조건에서 원심분리하고 상층액을 분리하여 500 μL isopropanol과 섞어서 실온에 10분간 반응 후 12,000×g, 15분간 4℃ 조건에서 다시 원심분리한 후 pellet을 80% EtOH로 washing 한다. 최종 pellet은 DEPC water에 녹여서 cDNA 합성에 이용하였다. cDNA 합성은 추출한 total RNA를 주형으로 oligo dT primer를 이용하여 PrimeScript II 1^st strand cDNA Synthesis kit로 65℃, 5분간 반응 후 얼음에 급냉 한 후 42℃, 60분간 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 낭충봉아부패병 바이러스 (SBV) 유전자를 증폭시키기 위하여 주형으로 사용되었으며, Forward primer 5ʹ-GAC CAA GAA GGG AAT CAG-3ʹ, Reverse primer 5ʹ-CAT CTT CTT TAG CAC CAG TAT CCA-3ʹ를 이용하여 낭충봉아부패병 (Sacbrood virus disease) 바이러스 유전자의 발현량을 측정하였고 control 유전자로는 β-actin 유전자를 이용하였다. qPCR은 최종 부피가 25 μL가 되도록 10 pmol 농도의 primer, 1×SYBR Green (Applied Biosystems), 1^st strand cDNA 1 μL를 섞어서 반응시켰다. 반응 최종 결과의 Ct 값 분석을 통해 바이러스를 정량 분석하여 (Applied Biosystems, user bulletin #2) 1×10⁶/mL의 농도로 봉군당 50 mL을 벌집에 스프레이하여 인공감염 시험을 하였다.

토종꿀벌 낭충봉아부패병 저항성 신품종 (한라벌)의 수밀력 우수성을 비교하기 위하여 한라벌과 농가에서 관행적으로 사육하고 있는 봉군에서 유밀기 (2019년 5월)에 화밀 (nector)을 수집하기 위하여 나가는 일벌 100마리와 수집 후 들어오는 일벌 100마리를 채집하여 무게 차를 측정하였다.

낭충봉아부패병에 대한 저항성을 보유하고 있는 신품종 토종꿀벌의 외형적 특징을 농가에서 관행적으로 사육하는 토종꿀벌과 비교한 결과, 전체적인 평균 체장은 일반 토종꿀벌 (Local) 12.85 mm 대비 저항성 신품종 (한라벌, R)은 13.59 mm로 상대적으로 길고 배 길이는 Local 6.47 mm, R 7.33 mm, 배 폭은 4.04 mm, 3.93 mm, 머리 폭 3.55 mm, 3.58 mm, 머리 길이 2.79 mm, 2.82 mm, 안테나 길이 4.17 mm, 4.08 mm, 겉날개 길이 8.50 mm, 8.67 mm, 겉날개 폭 2.69 mm, 2.89 mm, 속날개 길이 5.96 mm, 6.04 mm, 속날개 폭 1.55 mm, 1.64 mm, 날개 훅 수 18.31개, 18.49개, 뒷다리 대퇴골 길이 2.32 mm, 2.34 mm, 경골 길이 2.93 mm, 2.95 mm, 발목 길이 1.89 mm, 1.84 mm, 발목 폭 1.04 mm, 1.03 mm로 확인되었다 (Fig. 1). 낭충봉아부패병 저항성 신품종은 전체적인 체장, 배길이, 머리 폭, 날개의 길이 및 폭이 긴 특징을 가지고 있으며, 상대적으로 안테나의 길이는 짧은 것이 특징이다.

Fig. 1. 
Body parts of worker bees used for measuring morphometric characters. BL: body length, AL: abdominal length, AW: abdominal width, HH: head height, HW: head width, AL: antennal length, FWL: forewing length, FWW: forewing width, HWL: hindwing length, HWW: hindwing width, WH: wing-hooks, FL: femur length, TL: tibia length, BL: basitarsus length, BW: barsitarsus width. Local: Normal A. cerana from beekeepers, R: hallabeol. Bar is Standard deviation (SD).

꿀벌의 질병에 대한 저항성 여부를 확인하기 위한 방법으로 죽은 유충의 제거능력인 청소행동 특성을 비교하는 방법이 있다 (Gilliam et al., 1983; Palacio et al., 2000; Spivak and Reuter, 2001). 본 연구에서는 이러한 질병저항성을 판단할 수 있는 청소행동 특성을 비교하기 위하여 pin kill test를 실시한 결과, 낭충봉아부패병 저항성 신품종 (한라벌)의 경우에는 24시간 후 약 69%의 비율로 죽은 번데기 사충을 완전 제거하는 것으로 확인되었고 농가 관행 사육 토종꿀벌이 61.7%인 것과 대비하여 약 11% 정도 청소행동력이 우수한 것을 확인하였다 (Fig. 2). 48시간 이후에는 두 계통이 모두 100%에 가까운 청소행동을 보였다. 낭충봉아부패병은 꿀벌의 유충이 숙주이기 때문에 초기 감염 숙주를 제거하는 것이 질병저항성의 가장 중요한 특성이다. 따라서 본 연구결과에 따르면, 신규육성 토종꿀벌인 한라벌은 초기 청소행동 특성이 일반 토종꿀벌 대비 우수하여 낭충봉아부패병을 비롯한 기타 질병의 확산을 예방하여 봉군이 폐사하는 것을 예방하는 능력이 우수한 것으로 기대된다.

Fig. 2. 
Proportions of pin-killed pupae that were removed over time (24 hrs) by workers in the colonies of Apis cerana (hallabeol and control). Bar is Standard deviation (SD). (Significant difference at the P<0.01 level).

낭충봉아부패병 저항성 신품종의 가장 중요한 형질 특성인 낭충봉아부패병에 대한 저항성 여부를 확인하기 위하여 인위적으로 낭충봉아부패병 바이러스를 감염시켜서 병징의 발생 유무를 확인한 결과, 저항성 신품종 (한라벌)은 낭충봉아부패병 바이러스 감염 전에 번데기방의 수가 약 3,877개에서 바이러스 인공감염 45일 경과 후에도 약 3,592개를 유지하여 유충 단계에서 질병 발생이 없었음을 알 수 있다. 그러나 농가에서 사육하는 일반 토종꿀벌의 경우 인공감염 전 4,061개의 번데기 방이 인공감염 45일 경과 후 번데기방이 125개로 유충의 감소가 급격하게 발생하였다 (Table 1). 이러한 감염시험에 사용된 봉군의 일벌 수 변동률 또한 한라벌의 경우에는 인공감염 전 일벌 수가 6,184마리에서 인공감염 45일 경과 후 6,344마리를 유지하는 것을 확인하였다. 이와 대조적으로 저항성이 없는 농가 사육 일반 품종에서는 감염 전 평균 6,260마리였던 일벌이 감염 후 1,625마리로 감소하였다 (Table 2). 이는 Table 1에서 확인 된 바와 같이 유충이 부패하여 죽는 질병인 낭충봉아부패병을 유발하는 낭충봉아부패병 바이러스에 의하여 유충이 번데기가 되지 못하여 번데기 방의 수가 급격하게 감소하고 번데기에서 일벌 성충으로 우화하는 비율이 낮아진 결과이다. 따라서 토종꿀벌 낭충봉아부패병 바이러스에 저항성을 가지는 신품종 한라벌은 낭충봉아부패병이 유충기에 발생하지 않고 번데기를 거쳐 일벌로 우화하는 것을 확인하였다. 그 결과, 신규육성 토종꿀벌 품종인 한라벌은 낭충봉아부패병 바이러스에 감염되어 병징을 보이지 않으며, 이로 인한 봉군 폐사는 확인되지 않았다. 지난 2009년 이후 낭충봉아부패병 바이러스의 확산으로 토종꿀벌의 개체수가 약 2년 동안 농가 주장에 의하면 90% 이상, 농식품부 기타가축 통계에 의하면 75% 이상이 급격하게 감소하였으며 이후 농촌진흥청에서 보급한 우수여왕벌 양성 기술 및 개량벌통 사용 농가의 증가로 감소 추세는 줄었으나 지속적인 질병 확산으로 증식된 토종꿀벌) 봉군수와 유사하게 폐사하는 악순환이 연속되고 있는 상황에서 낭충봉아부패병 저항성 품종인 한라벌이 보급되면 점차적으로 토종꿀벌 봉군 수의 증가로 국내 낭충봉아부패병의 발병은 줄어들 수 있을 것으로 기대한다.

토종꿀벌 농가에서 관행적으로 사육하는 토종꿀벌의 일벌 개체 당 벌꿀 수집량이 20.7 mg에 비하여 한라벌의 경우, 일벌 개체 당 벌꿀 수집량이 23.7 mg으로 12.6% 수밀력이 우수한 것으로 확인 되었다 (Fig. 3). 따라서 향후 신품종 한라벌이 확대 보급됨에 따라서 토종꿀벌 사육농가의 벌꿀 생산량 증대를 통해 농가 벌꿀판매 소득도 증대 될 것으로 기대 된다.

Fig. 3. 
Compression of honey production with hallabeol and normal Apis cerans.