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본 연구에 사용한 로열젤리 시료는 2019년과 2020년에 생산한 생 로열젤리를 한국양봉농업협동조합 (Anseong, Korea)으로부터 구입하였다. 해당 로열젤리는 수확 직후 냉동보관 (-20℃)하였으며 운반 시에도 냉동 상태로 유지하였다. 외국산 로열젤리는 시장에 유통 중인 중국산 동결건조 로열젤리 5개 제품을 구입하여 사용하였다.

생 로열젤리는 초저온냉동고에서 급속 냉동시킨 후 동결건조기 (SFDSM24L, Samwon Freezing Engineering Co., Korea)를 이용하여 -35℃ 이하 온도에서 수분이 제거될 때까지 동결건조하였다. 동결건조한 로열젤리는 막자사발을 이용하여 분말화하였다.

동결건조한 로열젤리의 안정성 및 보관온도를 설정하기 위해 로열젤리 분말을 10 g씩 소분하여 각각 -20℃ (냉동), 25℃ (상온), 35℃, 40℃의 온도를 설정하여 1년간 보관하였다. 저장기간에 따른 성상의 변화 및 지표성분의 변화를 확인하기 위해 저장기간을 12개월로 설정하여 실험을 진행하였다.

동결건조된 로열젤리의 지표성분 (10-hydroxy-2-decenoic acid, 10-HDA)의 성분 분석은 식품의약품안전처의 식품공전 ‘10-HDA 일반시험법’에 따라 실시하였다 (KFDA, 2020a, 2020b). 표준물질인 10-HDA는 Wako chemical (Osaka, Japan)에서 구입하여 사용하였으며, 동결건조 로열젤리 시료 48 mg을 500 mL 부피플라스크에 넣고 물을 50 mL 넣은 후 50℃에서 진탕 후 메탄올 350 mL를 넣고 초음파 추출하였다. 추출 후 메탄올을 표선까지 채운 후 0.45 μm syringe filter로 여과하여 분석에 사용하였다. 10-HDA의 HPLC 분석 조건은 Table 1과 같다.

동결건조 로열젤리의 일반성분은 식품공전 식품성분시험법에 따라 측정하였다 (KFDA, 2020a). 수분함량은 105℃ 상압가열 건조법에 따라 측정하였고 회분 함량은 검체가 백색～회백색의 회분이 생성될 때까지 550～600℃에서 직접회분법을 이용하였다. 조단백질 함량은 시료의 전처리 및 추출과정을 거쳐서 Kjeldahl법에 따라 측정하였고 조지방 함량분석은 석유에테르를 추출용매로 Soxhlet 추출장치를 이용하여 Soxhlet 추출법에 따라 측정하였다. 탄수화물 함량은 검체 100 g 중에 수분, 회분, 조단백질 및 조지방 함량을 뺀 나머지 값으로 나타내었다.

동결건조 로열젤리의 보관 및 저장과정에서 발생할 수 있는 유해미생물인 대장균군의 분석을 위해 건조필름법을 실시하였다. 동결건조된 로열젤리 시료 100 mg을 증류수 1 mL에 녹인 후 이를 대장균군 건조필름배지 (3M^TM Petrifilm Coliform count plates, 3M Minnesota, USA)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 붉은 집락 주위로 기포를 형성한 집락 수 형성을 통해 대장균군 생성 여부를 확인하였다.

양봉산물 중 하나인 로열젤리는 생 로열젤리 상태에서는 점도, 색상 등과 같은 물리적 성상이나 단백질 변성, 아미노산 같은 화학적 성분의 차이가 저장 온도에 따라 영향을 받는 것으로 보고되어 있다 (Chen and Chen, 1995). 또한 로열젤리의 다양한 생리활성을 나타내는 주요성분이며 로열젤리 함유 제품의 규격관리 성분인 10-HDA의 함량 또한 저장 온도에 따라 차이를 보이고 있다 (한 등, 2012). 따라서 이러한 10-HDA의 함량 변화를 최소화하고 대량 생산 및 산업화에 용이하도록 로열젤리를 동결건조하여 분말화한 후 보관하는 제조공정을 도입하였다 (Fig. 1).

Fig. 1. 
Manufacturing process for the production of freeze-dried royal jelly.

이러한 제조공정은 크게 생 로열젤리의 채집 및 규격 검사, 동결건조, 분말화, 저장 보관 과정을 거쳐 장기간 보관 가능하게 된다. 생 로열젤리를 채집하게 되면 채집 즉시 냉동보관 (-20℃)을 하고 채집된 로열젤리가 식품의약품안전처에서 지정한 로열젤리 규격에 따라 규격검사를 실시하고 이를 만족하는 로열젤리를 콜드체인 온도가 -35℃ 이하가 되는 온도에서 동결건조를 실시하며, 동결건조된 로열젤리는 소규모 시료의 경우 막자사발 등을 통해 물리적으로 분쇄하며, 대규모 공정의 경우에는 분쇄기를 통해 분쇄한다. 식품공전 로열젤리류 기준 및 규격으로 10-HDA 함량은 1.6% (건조제품은 4.0% 이상), 수분은 65.5～68.5% (건조제품은 5.0% 이하), 조단백질은 11.0～14.5% (건조제품은 30.0～41.0) 그리고 건조제품에는 해당되지 않으나 생 로열젤리일 경우에는 산도는 32～53 (1N NaOH mL/100 g) 그리고 대장균은 n=0, c=1, m=0, M=10으로 설정하여 관리하고 있다 (KFDA, 2020a). 국산 동결건조 로열젤리의 10-HDA 평균 함량은 6.2±0.07%, 조단백질은 39.3±3.6% 그리고 수분은 2.1±0.8%로 본 제조공정을 통해 동결건조한 로열젤리의 규격은 모두 만족하는 것으로 확인되었다 (Table 2). 동결건조 로열젤리의 조지방과 회분 함량은 각각 7.3±1.7%, 2.7±0.1%로 측정되었다 (Table 2). 수입산 동결건조 로열젤리의 10-HDA 4.5±1.2%로 식품공전 규격에 적합하였으나 조단백질은 43.2±2.2%, 수분 함량은 6.0±2.0%로 기준치를 벗어났다.

동결건조한 로열젤리 분말의 보관온도와 저장기간에 따른 10-HDA 성분 변화를 확인하기 위해 동결건조 직후, 1개월 후, 6개월 후, 1년 후의 10-HDA 성분을 비교해본 결과 Table 3과 같았다. 동결건조 직후 분석한 10-HDA 함량은 6.2±0.07%였으며, -20℃에서 보관할 경우 1개월 후에는 6.18±0.13%였으며, 6개월 후에는 6.14±0.24%, 12개월 후에는 6.02±0.57%로 유의할 만한 차이를 보이지 않았으며, 이는 냉동 보관 시 1년 이상 10-HDA의 성분 변화 없이 보관이 가능한 것으로 확인되었다. 그리고 상온에 해당하는 25℃에서 보관할 경우, 6개월 이후 5.38±0.59%, 12개월 이후에는 4.94±0.20%로 10-HDA 함량이 유의하게 감소되는 것으로 확인되었다. 35℃의 경우 다소 고온에 노출된 경우로 이 경우에도 1개월 동안은 6.11±0.21%로 거의 변하지 않았으며, 6개월 이후에는 5.03±0.22%, 12개월 이후에는 4.74±0.30%로 유의한 감소를 보였다. 40℃의 경우에는 체온 이상으로 상대적으로 매우 고온에 지속적으로 노출된 경우를 의미하는 것으로 이 경우에는 1개월 이후에는 5.56±0.16%로 감소폭이 크지는 않지만, 6개월 (3.31±0.13%)이나 12개월 (2.72±0.28%) 등 장기간 노출될 경우 그 감소폭이 상대적으로 크다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 여러 보고에 의하면 생 로열젤리는 -20℃ 이하로 보관했을 경우엔 10-HDA 함량 변화가 거의 없으나 -20℃ 이상의 냉장 또는 실온에서는 10-HDA 함량이 크게 감소할 뿐만 아니라 단백질 부패 등으로 저장이 어려운 것으로 알려져 있다 (최 등, 1994; 한 등, 2012).

본 연구를 통해 동결건조 로열젤리는 1년 이상 장기 보관할 경우에는 -20℃ 이하 냉동 보관을 6개월 미만의 단기 보관은 실온에서도 기능 (지표) 성분인 10-HDA 성분 변화는 없는 것으로 확인되었다.

동결건조된 로열젤리를 보관하거나 가공하고 유통함에 있어서 대장균군과 같은 유해미생물의 발생은 문제가 될 수 있다. 따라서 건조필름법을 통해 대장균군과 같은 생물학적 위해요소의 발생 여부를 확인해 보았으며, 그 결과 온도와 상관없이 6개월간 보관한 동결건조된 로열젤리에서 대장균군이 발견되지 않음을 확인할 수 있었다 (Fig. 2).

Fig. 2. 
Detecting coliform in freeze-dried royal jelly by rehydratable film following storage period.

따라서 동결건조 로열젤리는 균일한 성분과 보관 중 성분의 안정성 그리고 위해물질에 대한 안전성이 높아 식품 소재로 활용에 적합한 것으로 사료되었다.