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계통 특이적인 SNP 마커 개발을 위한 GBS 분석은 국립농업과학원 시험양봉장에서 보존·육성중인 서양종 꿀벌(Apis mellifera) A, C, D, E, F 계통 96 개체에 대해 분석 되었으며, 개발된 SNP 마커에 대한 validation은 마찬가지로 국립농업과학원 시험양봉장에서 보존·육성 중인 서양종꿀벌 원종 계통인 A, C, D, E, F 및 교배조합 계통인 F×D 일벌 시료를 사용하였다.

GBS 분석을 위한 library 제작을 위해 서양종 꿀벌(Apis mellifera) A, C, D, E, F 계통, 96개체로 부터 Total genomic DNA를 분리하였다. Total genomic DNA는 DNeasy Blood and Tissue kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였으며, 추출된 genomic DNA는 분광광도계(spectrophotometer) (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 이용해 정량하였고, 정량된 genomic DNA는 50ng/μl 의 농도가 되도록 희석하여 분석에 이용하였다.

Genomic DNA는 SGB 분석을 위한 library 제작에 이용되었다. 본 연구에서는 PstI-MseI sequencing library를 제작하였으며, 이를 위해 SBG 100-Kit v2.0 (KeyGene N.V., Wageningen, the Netherlands)가 사용되었다. library 제작에 사용된 genomic DNA는 시료 당 250ng(50ng/μl) 이며, 총 2개의 세트로 library가 제작되었다. genomic DNA는 각 개체의 동일한 위치의 염기서열 비교를 위해 PstI과 MseI 제한 효소를 처리하였으며, 제한효소 반응은 37°C, 2시간 동안 수행되었다. 제한효소 처리된 시료는 Adapter ligation 및 PCR 증폭을 통해 library를 증폭 시켰으며, 이때 사용된 Adapter는 universal P7 MseI adapter(top oligo: 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3′-; bottom oligo: 5′-TACTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3′-NH2)로, 37°C, 3시간동안 ligation 반응이 이루어졌다. Adaptor ligation이 완료된 시료는 Library 증폭을 위해 1/10 희석하여 PCR 증폭반응을 수행하였으며, 이때 사용된 primer는 KeyGene사에서 제공하는 MseI primer와 PstIPrimer이다. 반응 조건은 72°C 2분간 반응 시킨 후 94°C 30초, 67°C 2분, 72°C 2분간 13 cycles을 반복하고, 다시 30초, 58°C 2분, 72°C 2분간 37 cycles을 반복하였다. 제작된 library는 Qiagen MinElute column으로 정제한 후 flowcell에 부착하여 cluster를 합성하였으며, Hiseq 2500(illumina)을 통한 single end 서열분석법을 이용해 101 cycles의 조건으로 염기서열을 분석하였다. 이 후SBG clustering, read-mapping 및 SNP-calling 등은 KeyGene사에서 제공하는 SBG bioinformatics pipeline을 통해 수행되었다.

분석된 SNP data는 마커로서 효율성을 높이기 위해 depth(read 수), variation call rate(frequency) 등을 고려하여 filtering 하였으며, 이를 통해 유효한 SNP 마커를 포함하는 sequence 17종을 선발하였다(Table 2). 선발된 sequence는 TaqMan probe 방식의 마커를 제작하였으며, 이를 위해 Primer Express 프로그램(ABI)을 이용해 locus 특이적 PCR primer 및 allele 특이적 probe를 디자인 하였다. 이때, D계통 allele 특이적 probe는 5에 FAM 형광을 표지하였고, 그렇지 않은 allele probe는 VIC 형광을 표지하였으며, multicomponent plot을 이용해 genotyping 분석을 수행하였다. 제작된 SNP 마커 및 프로브는 꿀벌 계통 A, C, D, E, F, F×D에 대한 일벌시료로부터 genotype 분석을 수행하였다. 먼저 각각의 꿀벌 계통 일벌 10마리에 대한 genomic DNA를 DNeasy Blood and Tissue kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 분리한 다음, SNP 마커 primer 및 probe를 이용해 RT-PCR를 수행하였다. RT-PCR 반응은 ABI 7500 real time PCR machine (Applied Biosystems)을 이용하여 수행되었으며, 2x Quantinova PCR master mix (Qiagen) 12.5ul, 40x primer/probe mix (Applied Biosystems)를 0.675ul 넣은 후 각 꿀벌에서 추출한 genomic DNA를 5ul (약 50ng)넣고 95도에서 10분 간 반응시킨 후 95도 15초, 60도 1분으로 40 cycles 반응하고 각 cycle마다 FAM과 VIC의 형광수치를 확인하였다.

본 연구에서는 ‘장원벌’ 부계인 D계통 특이적인 SNP 마커 개발을 위해 SBG 분석이 수행되었다. SBG 분석은 국내에서 육성중인 5개 꿀벌 계통 A, C, D, E, F에 대해 이루어졌으며, 일벌 96개 개체를 2개의 세트로 나누어 수행하였다. 분석 결과 각각 209,815,904,213,383,387의 read가 분석 되었으며, 총 423,199,291의 read, 42 GB의 assemble sequence를 확보할 수 있었다. GC contents는 각각 53.56%, 53.48%인 것으로 확인 되었으며, 분석 품질을 확인 할 수 있는 Q30(base가 잘못 읽혀질 가능성이 1/1000)은각각84.69, 85.84으로 비교적 높은 것으로 확인되었다. Sequence 결과를 토대로 SBG bioinformatics pipeline을 통한 SNP-calling 및 annotation 분석을 수행 하였으며, 그 결과 D 계통 특이적인 SNP loci를 가지는 1,029개 sequence는 선발할 수 있었다.

선발된 1,029개 sequence는 annotation 결과 및 depth(read 수), variation call rate(frequency) 등을 고려하여 추가적으로 17개의 sequence를 선발 하였다(Tbale 2). 선발된 sequence는 D 계통 특이적인 SNP loci를 포함하고 있으며, 180 이상의 높은 coverage를 보이고 있었다. 이들 sequence에 대한 genome annotation 결과에 따르면, 해당 sequence는 signal transduction 및 odorant receptor, membrane integral component 등과 관련된 유전자를 포함하고 있는 것으로 확인되었다. 이 결과는 이후 꿀벌 계통의 표현형(phenotype)과 밀접한 관련이 있을 것이라 생각하고 관련 연구를 지속시킬 필요가 있어 보인다.

선발된 sequence는 각각의 SNP loci를 포함하는 영역 특이적인 마커를 제작하는데 사용되었으며, 본 연구에서는 TaqMan probe를 이용한 마커가 제작 되었다. 특히 D계통 특이 allele을 가지는 염기서열에는 VIC 형광(Green), 그렇지 않은 염기서열은 FAM 형광(Blue)을 표지하였다. 제작된RT-PCR primer 및 마커는 꿀벌 genomic DNA에 대한 RT-PCR 반응을 수행하였고, 반응성이 우수한 10개 primer 마커를 추가로 선발하였다(Table 3).

선발된 10개의 SNP 마커가 장원벌 수벌계통(D)을 특이적으로 판별 할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 각각의 primer에 대한 genotyping을 A, C, D, F 원종 계통 및 F×D 교배 계통에 대해 수행하였다. 그 결과, RT-PCR 반응성이 높으면서 D 계통을 특이적으로 검출할 수 있을 것으로 판단되는 AmD6, AmD9 2개의 후보를 선발하였고, 최종적으로 AmD9을 장원벌 수벌계통 (D) 특이마커로 선발하였으며(Fig. 1, Table 4), 이에 대한 결과는 다음과 같다. 먼저, AmD6 마커의 경우, D계통 특이 allele을 가지는 probe는 VIC 형광이 표지되어 있었고 그렇지 않은 allele을 가지는 probe는 FAM 형광이 표지되어 있었다. genotyping 결과 A, C, E, F 계통에 대해서는 VIC 형광이 전혀 검출되지 않은 것으로 나타났으나, D 계통의 경우 10개 꿀벌 개체 중 6개 개체에서 VIC 형광이 검출되었다. 그러나 D계통 중 나머지 4 개체에서는 FAM/VIC 형광이 동시에 검출되어 D 계통 판별력에 대한 정확도(Accuracy rate)는 60%에 그치는 것으로 확인 되었다. 반면, AmD9 마커의 경우 A, C, F 계통에 대한 genotyping 결과는 AmD6 마커와 마찬가지로 10개 꿀벌 개체 모두 VIC 형광이 전혀 검출되지 않았다. 그러나 D 계통의 경우 모든 개체에서 VIC 형광이 검출되어 D 계통 판별력에 대한 정확도는 100% 인 것으로 확인되며, 이는 AmD6 마커에 비해 보다 높은 판별력을 지니는 것으로 판단되었다. AmD9 마커는 단일계통인 D 계통에 대해서만 높은 효율의 정확도를 보이는 것이 아니라, 교배조합계통 D×F에 대해서도 높은 효율로 판별 할 수 있는 것으로 확인되었다. 즉 AmD6 마커의 경우 교배조합계통 D×F 10개 개체 중 단 2개체만이 FAM/VIC 형광이 동시에 검출되어 교배조합 계통에 대한 D 계통 판별력은 다소 떨어지는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 AmD9 마커의 경우 교배조합계통 D×F 10개 개체 모두 FAM/VIC 형광을 동시에 검출하여 교잡계통에 대한 판별력이 AmD6에 비해 높은 것으로 나타났다(Table 3). 이 결과는 다음 세대에 육성된 D 계통 일벌에 대한 genotyping 결과 에서도 역시 확인 할 수 있었다. 즉 다음 세대에 육성된 3개의 D 봉군에서 확보한 일벌 샘플은 모두 VIC 형광이 검출되어 높은 판별력을 보이는 것으로 확인되었다(Fig. 2)

Fig. 1. 
Multi-component plot of the real-time PCR result of Apis mellifera reared in Korea using AmD9 marker.

Fig. 2. 
Multi-component plot of the real-time PCR result of the next generation of D lines using AmD9 marker.

꿀벌 육종에 있어 꿀벌의 유전적 마커는 다양한 측면에서 활용이 가능하다. Meixner 등(2013)은 꿀벌의 아종 분리를 위한 여러 가지 기술적 분석으로 mitochondrial DNA, microsatellite, SNP 등에 대해 기술한 바 있으며, Oxley 등(2010)등은 꿀벌의 청소력 우수계통을 육성하고 이와 관련된 QTL(Quantitative trait locus) 영역을 유전자 마커로 활용하여 질병저항성 계통을 육성 기반을 마련하기도 하였다. 특히 꿀벌 육종연구는 표현형 관찰이 상대적으로 용이한 질병저항성과 관련된 연구가 주를 이루고 있어, 이와 관련한 유전형 마커에 관한 연구도 많이 이루어져 왔다. 그러나 본 연구에서와 같이 꿀벌의 수밀력과 관련된 육종 및 유전형 마커와 관련된 연구는 거의 이루어지지 않아 관련 연구의 확대가 절실한 상황이다. 본 연구에서는 국내 최초로 육성된 수밀력 우수계통인 ‘장원벌’ 계통 판별 마커 개발을 위해 장원벌 부계인 D 계통 특이적 마커인 AmD9를 개발하였다. AmD9 마커와 관련된 유전자는 Apis mellifera UPF0489 protein 인 것으로 확인되고 있으며, 이는 C5orf22 유전자와 상동성이 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나 현재까지 본 유전자에 대한 정확한 기능은 밝혀져 있지 않아 추후 관련 연구를 통해 수밀력과의 관련성을 밝힐 수 있을 것으로 기대하고 있다.