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본 연구의 공시품종은 경기도 화성시 매송면 어천리에 소재한 국립산림과학원 밤나무 품종보존원에 식재되어 있는 평균수고 8m, 흉고직경이 30cm인 밤나무 4품종(대보, 옥광, 이평, 축파)에서 각각 3본을 조사목으로 선정하였다. 총 12본의 조사목에서 수꽃과 암꽃 개화시기를 조사하였으며, 화밀특성에 대한 조사는 개화기간 중 전체 수관을 중심으로 개화율이 60~80%일 때 조사를 실시하였다. 연구 공시 품종의 육성내역은 Table 1과 같다.

밤나무 주요 품종별 개화시기를 구명하기 위하여 수꽃과 암꽃의 단계별 개화시기를 조사하였고(Fig. 1), 개화 단계는 화아발생부터 개화종료까지 수관 전체를 육안으로 판단하여 4단계로 구분하였다(Table 2). 또한, 수꽃차례(catkin)의 형태적 특성조사는 선정된 조사목별로 4방위에서 완전히 개화한 수꽃차례를 20개씩 채취하여 길이와 직경을 디지털 캘리퍼스(NA500-150S)로 측정하였다.

Fig. 1. 
Pictures of a chestnut tree including male and female flowers.

꿀벌 및 방화 곤충에 의한 밤나무 화밀 손실을 방지하기 위해 교배봉투를 조사목 당 3개씩 씌웠으며, 화밀 분비량을 정량하기 위해서 개화한 수꽃차례를 수집하여 수술을 제거한 후 원심분리기(Microfuge 16, Beckman Coulter, USA)를 이용하여 2,000 rpm으로 6분 간 처리하여 화밀을 분리하였다. 500μl microliter syringe(Hamilton, USA)를 이용하여 화밀을 정량화하고 채취한 양을 기록한 후 품종별 수꽃차례 하나의 화밀량을 추정하였으며 휴대용당도계(GMK-703T, Giwonhitech, Korea)를 이용하여 화밀 당도를 측정하였다.

또한, 유리당과 유리마이노산 분석을 위해 HPLC 분석 전까지 화밀을 0.45μm membrane filter(Whatman, UK)에 필터링한 후, 정제된 화밀을 80% 에탄올로 10배 희석하여 Eppendorf vial에 화밀을 고정한 다음 초저온냉장고(-70°C)에 보관하였다.

수집된 화밀 시료는 HPLC(Dionex ultimate 3000, Dionex, USA)를 이용하여 분석하였다. 이동상으로는 3차 증류수를 사용하였고, 유속은 0.5 ml/min으로 하였으며, 온도는 80°C로 설정하였다. Ri-101 detector(Shodex, Japan)로 검출하였으며, Aminex 87P column(Bio-rad, USA)을 사용하였다. 함량은 적분계에 의한 외부표준법으로 계산하였으며, 표준품으로는 Sucrose, Glucose, Fructose, Galactose(Sigma, USA)를 사용하였다.

채취된 화밀 시료의 아미노산을 O-phthalaldehyd(OPA)-Fluorenylmethyl chloroformate (FMOC) 유도체화하여 분석하였다. Borate buffer, OPA/Mercaptopropionic acid(MPA), FMOC 시약에 시료를 단계적으로 혼합한 다음, HPLC(1200 series, Aglient, USA)를 이용하여 분석하였다. 이동상은 10mM Na₂HPO₄, 10mM Na₂B₄O₇·10H₂0가 포함된 A용액(pH8.2)과 Water: Acetonitrile:Methanol=10:45:45로 혼합된 B용액에 대하여 A용액:B용액으로 초기 100:0 (v/v,%)에서 26~28분에 55:45, 28~30.5분에 0:100, 30.5분부터는 100:0으로 구배 조건을 설정하였다. 유속은 1.5ml/min.로 하였고 주입량은 1ml 설정하였으며 컬럼 온도는 40°C로 설정하여 Inno column C18 (Innopiatech, Korea)을 사용하였다. 검출기는 자외성 검출기와 형광 검출기를 연결시켜, 자외선은 338nm에서, OPA유도체는 방출 파장은 450nm, 여기파장은 340nm, FMOC유도체의 방출 파장은 305nm, 여기 파장은 266nm에서 검출하였다.

조사된 자료는 SPSS program(Statistical Package for Social Science, ver. 12.)을 이용하여, 수꽃차례 형태적 특성과 화밀 특성에 대한 Spearman 상관분석을 실시하였으며, 품종 간 또는 요인 간 차이를 검정하기 위해 ANOVA 분석을 실시한 후, 유의미한 차이를 보인 요인에서 Duncan의 다중검정을 실시하였다.

암꽃과 수꽃의 개화시기를 개화시작(FB; Flowering beginning), 만개시작(FBB; Full bloom beginning), 만개종료(FBE; Full bloom end), 개화종료(FE; Flowering end) 4단계로 구분하여(박 등, 2011) 국립산림과학원 산림유전자원부 어천 시험림에 식재된 밤나무 4품종에 대해 조사한 결과는 Table 3과같다.

조사된 암꽃의 경우 ‘축파’가 5월 31일에 가장 빨리 개화하였으며, 다른 3품종은 모두 6월 3일에 개화를 시작하였다. 4품종 모두 암꽃이 먼저 개화를 시작하고, 이후 수꽃이 개화를 시작하였으며 그 차이는 평균 8일이었다. 수꽃의 개화개시부터 종료까지 기간은 품종에 따라 약간의 차이는 있으나 평균 9일 내외로 나타났는데, ‘이평’의 수꽃개화시작이 6월 8일로 가장 빨랐고, 이후 ‘옥광’, ‘축파’, ‘대보’ 순으로 개화를 시작하였다. 대체로 수꽃의 만개종료(FBE) 시점에서 암꽃은 개화종료(FE) 단계에 접어드는 양상을 나타냈다. 전체 4품종의 암꽃 개화시간은 평균 14일, 수꽃은 평균 11일의 개화기간을 나타냈으며 암꽃과 수꽃의 개화시기를 모두 고려하면 4품종의 밤나무는 평균 19일의 개화기간을 나타냈다.

밤나무의 개화 특성은 식재 지역과 당해년도 기후 등에 의해 영향을 받는다는 것이 여러 논문에서 보고된 바 있다(김 등, 2003; 박 등, 2011). 김 등(2003)에 의하면, 본 연구 대상지와 동일한 어천시험림에 식재한 밤나무 27품종에 대한 조사결과 대부분 암꽃이 먼저 개화하는 것으로 관찰되어 본 연구결과와 동일한 경향을 나타냈으며, 박(2011)은 남부 지역의 밤나무 개화시기가 경기도 화성 지역보다 약 10일 이상 빠르다고 보고하였고, 암꽃이 수꽃에 비해 저온에 더 민감하게 반응한다고 보고한 바 있다. 본 연구는 수꽃보다 암꽃의 빠른 개화 시기로 조사되어 기존의 연구결과들과 유사하였으나, 밤나무 품종 고유의 개화시기 특성을 정확히 파악하기 위해서는 지역별, 품종별로 기후인자를 고려한 개화시기 모니터링이 지속적으로 필요하다고 판단된다.

주요 밀원수종인 쉬나무는 수꽃 한 개당 평균 2.73±0.63μl, 암꽃 한 개당 0.63±0.49μl의 화밀이 분비됨을 보고된 바 있고(김 등, 2014a), Silene속에 속하는 3종 (S. alba, S. dioica, S. nutans)의 수꽃은 암꽃보다 화밀 농도가 높은 것으로 보고된 바 있다(Witt et al., 1999). 이와는 달리, Cucurbita pepo, Euterpe precatoria와 같이 암꽃 화밀 농도가 수꽃보다 더 높은 수종들에 대해서도 연구된 바 있다. 이러한 결과들은 식물 종마다 수꽃과 암꽃의 화밀특성 차이가 있는 것을 의미한다. 밤나무의 경우 암꽃보다 수꽃에서 화밀이 주로 분비되며, 한 본에서 수꽃이 약 90% 이상, 암꽃이 10% 이내의 비율을 차지하기 때문에 수꽃차례의 형태적 특성과 화밀 분비량만을 조사·분석하였다(Table 4).

분산분석과 Duncan 검정을 통해 조사 된 모든 형질에서 품종 간 차이를 확인할 수 있었다. 밤나무 수꽃차례의 길이는 4품종에서 평균 17.1±2.0cm을 나타냈고, 수꽃차례의 직경은 2.7±0.5mm, 수꽃차례 당 꽃수는 평균 101.2±16.9개로 나타냈다. Catkin 당 화밀 분비량은 ‘옥광’이 54.3±30.9μl로 가장 많은 화밀량이 분비된 반면 ‘대보’는 가장 적은 6.7±4.3μl의 화밀 분비량을 나타냈다. 휴대용 당도계로 수꽃차례의 화밀 당도를 측정한 결과, ‘대보’가 57.1%Brix로 가장 높은 수치를 나타냈고‘옥광’이 18.2%Brix로 가장 낮은 수치를 보였다.

주요 밀원수종으로 분류되는 밤나무의 본당 총 화밀량을 추정하기 위해서는, 표준적인 재배지침에 의해 관리된 밤나무의 수꽃차례 개수 조사가 필요하다. 본 연구에서는 수꽃차례 당 화밀량만을 제시했기 때문에, 본당 총 화밀량을 계산하기 위해서는 총 수꽃차례 개수에 대해서 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

수꽃차례 특성과 화밀분비 특성을 Spearman의 상관관계를 이용해 분석한 결과는 Table 5와 같다. 분석 결과, 밤나무의 화밀 분비에 있어서 영향을 끼치는 인자는 수꽃차례의 직경으로 판단된다. 수꽃차례당 꽃수는 수꽃차례의 길이와 고도의 정의 상관(r=0.950, p=0.01)을 나타냈으나, 수꽃차례의 직경과는 상관이 없음을 알 수 있었다. 수꽃차례 당 화밀 분비량은 수꽃차례의 길이와 상관이 없으나, 수꽃차례의 직경과 높은 정의 상관(r=0.844, p=0.01)을 나타내었다. 또한 화밀 분비량과 화밀 당도는 높은 부의 상관(r=-0.725, p=0.01)을 나타냈다. 이러한 결과는 김 등(2014a)이 쉬나무 꽃에서 총 화밀량과 화밀 당도는 부의 상관관계(r=-0.746, p=0.01)를 보였다는 보고와 유사한 경향을 나타냈다.

HPLC에 의해 조사된 밤나무의 주요 유리당 함량과 수꽃차례 당 당함량을 분석한 결과는 Table 6과같다.

화밀 내 유리당 함량은 벌꿀 생산량을 간접적으로 추정할 수 있어 밀원수종으로서 가치 평가에 유용할 뿐만 아니라, 화밀의 당 구성은 수분매개자들의 화밀섭식에 영향을 준다고 알려져있다(Pacini et al., 2003). HPLC를 이용하여 유리당 분석을 수행한 결과, ‘대보’가 4품종 중에서 가장 높은 유리당 함량을 보였다. 유리당 함량과 화밀 당도 값은 4품종 모두 동일한 경향을 나타냈고, 화밀 당도와 부의 상관을 가지는 수꽃차례 당 화밀 분비량은 유리당 함량과 반대의 경향을 보였다. 또한, 단위용량 당 유리당 함량과 수꽃차례 당 화밀 분비량을 고려하면, ‘축파’가 1401.6μg, ‘옥광’이 777.5μg, ‘이평’이 708.9μg, ‘대보’가 486.4μg의 순서로 수꽃차례 당 당함량을 산출할 수 있다. 이 결과에서는 수분을 포함한 수꽃차례 당 화밀 분비량과 벌꿀 생산과 관련되는 화밀 내 유리당 함량을 고려하였을 때, 4품종 중에서 ‘축파’가 밀원적 가치가 높다고 판단된다. 하지만 이 결과는 수꽃차례 하나만을 고려한 결과 값이기 때문에 수확 가능한 꿀의 양을 추정하기 위해서는 품종별 본당 수꽃차례 개수 조사와 꿀벌 방화 활동 요인 등을 고려한 연구가 추가적으로 필요하다고 판단된다.

Fig. 2는 HPLC에 의해 분석 된 주요 유리당 함량을 비율로 나타낸 그래프이다. 분석 된 4품종 모두 Hexose(glocose, fructose, galactose) 함량이 Sucrose보다 우세했고, Hexose 중에서도 특히 fructose가 전체 화밀 유리당 함량의 71.4%를 차지했다. Sucrose/Hexose ratio는 ‘대보’가0.12를나타냈고, ‘대보’ 를제외한 3품종은 0.1 이하의 값을 나타내어 전체적으로 밤나무 화밀은 단당류가 많은 함량비를 차지하는 hexose-dominant 등급을 보였다(Baker and Baker, 1982). 이러한 결과는 Kim et al.(2012)이 보고한 피나무 화밀에서 fructose 함량이 44.3~77.9%로 전체적으로 높았던 결과와 유사한 경향을 나타냈으나, 0.22(hexose-rich)와 0.72(sucrose-rich)를 나타낸 피나무 화밀 등급과는 다른 결과를 보였다. 또한, 김 등(2014a)이 보고한 쉬나무 수꽃과 암꽃 화밀에서는 fructose의 함량은 12.1% 와 19.6%를 나타냈고, sucrose 함량은 각각 71.4%, 52.8%를 나타냈으며, 화밀 등급은 2.5, 1.2(sucrose-dominant)를 나타낸 결과와 비교하였을 때, 밤나무 화밀 유리당 구성과 상반된 결과를 나타냈다.

Fig. 2. 
Ratio of sugar composition in nectar from the major jour chestnut cultivas.

HPLC에 의해 조사된 밤나무 4품종 수꽃 화밀의 아미노산 비율을 분석한 결과는 Table 7과 같다.

수꽃차례 화밀에서는 proline, glutamic acid, asparagine, alanine 등이 평균적으로 우점하는 아미노산이었다. ‘대보’는 proline, asparagine, alanine, glutamic acid, glutamine 순으로 많은 함량비를 차지하였으며, 전체 화밀아미노산의 69.9%를 차지하였다. ‘옥광’은 proline, asparagine, GABA(Gamma aminobutyric aicd), serine, glutamic acid 순으로 전체 화밀 아미노산의 68.5%를 차지했다. ‘이평’은 proline, asparagine, alanine, glutamic acid, GABA 순으로 64.4%의 누적 함량을 나타냈고, ‘축파’는 proline, glutamic acid, serine, aspartic acid, alanine 순으로 62.6%의 함량을 나타냈다. proline, asparagine 순으로 우점하는 ‘대보’, ‘옥광’, ‘이평’과 달리 ‘축파’는 proline에 이어 glutamic acid가 높은 함량을 나타냈다. 특히 모든 품종에서 proline 함량비가 평균 28.1%로 가장 높은 아미노산 구성 비율을 나타냈다. proline은 여왕벌의 산란을 위해 필요하고 곤충의 발달과 날개근육의 빠른 산화를 위해 필요하기 때문에 proline이 풍부한 화밀이 꿀벌에게서 높은 선호도를 보인다(Hrassnigg et al., 2003). 또한, 4품종 모두 tryptophan은 검출되지 않았으며, methionine은 ‘옥광’과‘축파’에서 미량 검출되었다. 아미노산 구성 비율에 대한 품종 간 유의성을 검정하고자 분산분석을 실시한 결과, 품종 간에 aspartic acid, glutamic acid, asparagine, serine, threonine, alanine, GABA, phenylalanine, isoleucine 등 9개 아미노산 구성 비율에서 유의적인 차이가 확인되었다. 특히 ‘대보’, ‘이평’, ‘축파’에서는 alanine 함량이 ‘옥광’에 비해 유의적으로 높았으며, 반대로 ‘옥광’은 다른 품종들보다 유의적으로 높은 GABA 함량을 나타냈다. GABA와 phenylalanine은 지중해 지역 식물의 화밀 아미노산에서 꿀벌과 가위벌과의 선호도에 큰 비중을 차지하고 있는 것으로 알려져 있다(Petanidou et al., 2006). 본 연구에서는 GABA가 평균 7.4% 함량비를 나타냈고, phenylalanine이 1.7%의 낮은 함량비를 나타냈다. 특히 phenylalanine은 쉬나무 수꽃과 암꽃 화밀에서는 검출되지 않았고, 때죽나무 화밀 내에서는 1.0%의 낮은 함량을 나타낸 반면, 황칠나무 화밀에서는 67.2%의 함량을 나타내 상반된 결과를 나타냈다(김 등, 2014a; Kim et al., 2015; 김 등, 2015). 본 연구에서는 밤나무 주요 품종 간 수꽃 화밀의 아미노산 구성과 함량 정도에 차이가 있음을 확인함과 동시에 밤나무 수꽃 화밀에서 우점하는 아미노산의 종류를 확인할 수 있었다.