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본 실험에 사용된 메밀벌화분(메밀화분)은 2016년 전북 김제시 새만금간척지 메밀밭에서 꿀벌 벌통 입구에 화분 채집기를 설치하여 약 2주간 수집하였으며, 수집된 시료는 현미경 관찰 하에서 95%이상 순도를 유지하는 시료를 선발한 다음 -20°C에서 냉동보관하면서 분석에 이용하였다.

화분의 수분 함량은 AOAC법(2010)으로 무게를 잰 후 Dry oven (Wiseven WOF-105, Daihanscientific, Korea)에서 105°C로 건조하여 정량하는 상압가열건조법으로 반복 측정하였다. 조지방은 Soxhlet 추출기(2050 SOXTEC, FOSS, Sweden)를 사용하여 diethyl ether로 추출하여 정량하였으며, 단백질은 semimicro-Kjeldhl법으로 자동 단백질 분석기(Kjeltec 8400, Foss, Sweden)로 측정하였고 여기에 화분의 질소계수 6.25을 곱하여 단백질 함량으로 환산하였다. 조회분은 600°C 회화로(JSMF-270T, JSR, Korea)에서 건식회화법으로 측정하였다(한국식품공전, 2016).

메밀화분의 아미노산 분석을 위하여 건식분해법을 사용하여 전 처리하였다. 화분 약 5~20g을 취해 80°C에서 예비 건조한 후 450~550°C에서 회화하였다. 얻어진 회분에 염산(1+1) 10mL를 가하여 상온에서 3∼5시간 반응시킨 후 반응액을 여과지(Whatman NO. 5A)로 여과 후 50mL Volumetric flask에 정확히 정용하여 시험용액으로 사용하였으며, 표준품은 accu standard를 사용하였다. 시스테인, 메치오닌, 트립토판 이외의 아미노산 정량용 시험용액 단백질로서 약 10mg을 함유하는 검체를 가수분해 시험관에 정밀히 달아 넣는다. 0.05%(w/v) 2-mercaptoethanol을 함유한 6N 염산을 단백질양에 대하여 약 1,000배량 즉, 10mL를 가하였다. 드라이아이스·에탄올로 동결한 후 탈기장치에 장착하여 융해, 동결을 수회 반복하며 충분히 탈기 하였다. 봉관하여, 정온가열로에서 110±1°C, 22~24시간 가수 분해하고, 종료 후 봉관을 절단하여 즉시 감압하여 40°C에서 농축 건조하여 염산을 제거하였다. 염산을 최대한 제거하기 위하여 잔사에 물을 가해 다시 농축 건조한 후 0.2 N 구연산나트륨 완충액(pH 2.2) 또는 0.02 N 염산용액으로 일정량으로 만들어 시험용액으로 하였다. 침전이 있는 경우에는 멤브레인 필터를 사용하여 여과하였다. 시스테인, 메치오닌 아미노산 정량용 시험용액은 단백질 약 10mg 함유하는 검체를 정밀히 달아 미리 0°C로 냉각시켜 놓은 과개미산 용액 10mL를 가하여 단백질이 가용성인 경우 0℃에서 4시간, 불용성인 경우 0°C에서 하루 밤 방치하였다. 방치 후 공기를 흡입하고 소량의 물을 가해 동결건조하였다. 잔사를 0.05%(v/v) 2-mercaptoethanol 함유의 6 N 염산 10mL를 사용하여 가수분해 시험관으로 옮겼다. 동결한 후, 탈기장치에 장착하여 충분히 탈기한 후 봉관하여 110±1°C에서 18시간 분해하였다. 시스테인, 메치오닌, 트립토판 이외의 아미노산 정량용 시험용액 따라 시험용액을 조제하였다. 트립토판 정량용 시험용액은 단백질 10mg을 함유하는 검체를 가수분해 시험관에 정밀히 달아 넣고, 가용성 전분 100mg을 가한 다음 4.2 N 수산화나트륨용액 3 mL를 가하였다. 동결시킨 후, 탈기장치에 장착하여 충분히 탈기하고 밀봉하여 135±1°C에서 22시간 가수분해하였다. 가수분해 후 봉관을 잘라 열고 6 N 염산으로 중화하여 0.2 N 구연산나트륨완충액(pH 4.25)으로 일정량을 만들어 시험용액으로 하였다. 용액이 탁한 경우 30,000~40,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 상등액을 취하였으며, Table 1과와 같은 조건으로 분석하였다(AOAC 2010).

화분의 비타민 분석은 B₁, B₂, B₃, C에 대하여 실시하였다. 표준품은 모두 Sigma사(St. Louis, Mo, USA)로 부터 구입하여 사용하였으며, 시약은 HPLC 등급을 사용하였다. 비타민 B₁ 분석을 위하여 화분 시료는 mg 단위로 정확하게 측량하였고, 5mM sodium hexanesulfonate 용액 50 ml을 가하여 30분간 초음파진탕기로 추출한 후 50ml로 정용하고, 3,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 0.45um 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용하였다. 비타민 B₂ 분석은 화분 시료를 mg 단위로 정밀히 담아 적당량의 3차 증류수를 가한 다음 75∼80°C 온탕에서 20분간 추출하여 50mL 로 정용 후 멤브레인필터로 여과후 시험용액으로 사용하였다. 비타민 B₃ 분석은 화분 시료를 mg 단위로 측정하여 5mM sodium hexanesulfonate 용액을 적당히 가하여 30분간 초음파진탕기로 추출한 후 50mL로 정용하고, 3,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 0.45um 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용하였다. 비타민 C의 분석은 화분을 5% metaphosphoric acid (Wako) 20mL로 시료를 균질화(Ultra-Turrax T25, IKA Labo, Germany)하여 총량 50mL까지 정용 후, 초음파추출기로 30분간 추출후 refrigerated centrifuge(5804R, Eppendorf, Germany) 12,500×g로 10분간 원심분리한 뒤 상등액을 취하여 0.45um 필터로 여과하여 시험용액으로 하였다. 비타민 분석은 HPLC(NANOSPACE SI-2, SHISEIDO, Japan)와 PDA Detector를 사용하였다(Table 2).

미량원소 함량은 한국식품공전 분석방법(2016)에 따라 분석하였다. 시료를 105°C에서 16시간 건조하여 마쇄한 다음 0.5g을 취하여 600°C 회화로에서 2시간 회화시킨 후 냉각하였다. 회화된 시료는 microwave(Mars5, Mars6, CEM, USA) 분해용기에 넣고 질산용액(HNO₃:H₂O＝1:1) 7 mL을 첨가하여 24시간 분해시킨 후 염산용액(HCl:H₂O＝1:1)을 가하여 24시간 용해시킨 다음 여과지(Whatman No. 6, Maidstone, England)로 여과하여 분석시료로 이용하였다. 분석조건은 Table 3과 같으며 유도결합플라즈마 (Inductively Coupled Plasma, PerkinElmer Optima 8300, USA)을 이용하여 정량하였다.

메밀화분의 항산화활성은 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)를 사용하여 자유라디칼소거능으로 측정하였다(Liangli et al., 2002). 96 well plate에 화분 추출물 10μl와 0.2mM DPPH 190μl를 균일하게 혼합하여 실온에서 30분간 정치한 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능을 구하는 식은 다음과 같다.

메밀화분의 총페놀함량은 Folin-Ciocalteu 방법을 사용하여 측정하였다(Beretta et al., 2005). 화분 추출물 1mL과 1N Folin-Ciocalteu reagent 1mL를 첨가하고 증류수 5mL를 넣은 후 5분 동안 상온에 방치한 다음 7% Na₂CO₃ 1mL를 넣고 혼합한 후 실온에서 30분간 방치한 후 UV/Vis spectrophotometer (Molecular device spectramax M2e, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 630nm에서 흡광도를 측정하였다.

메밀화분의 일반성분을 분석한 결과는 Table 4와 같다. 조단백질 함량은 14.43%로 다래화분 35.8%와 도토리화분 22.3%보다 낮았으나 송화분 14.0%와 벼화분 15.66%와 유사하였다(홍 등, 2013a; 최와 정, 2004; 이 등, 1997; 홍 등, 2016). 메밀화분의 조지방 함량은 5.67%로 도토리화분 11.8%와 다래화분 8.7%보다 낮았으나 족제비싸리화분 3.12%, 송화분 3.0%와 유채화분 3.2%보다 높았다(홍 등, 2013a; Hong et al., 2016; 이 등, 1997; 김과 손, 1990). 화분의 일반 성분은 밀원과 지역의 외적 환경요인에 따라 차이가 있다. 탄수화물 함량의 비중이 높으면 밀원 분포상 초본류식물의 화분 유입이 많은 것으로 판단되며 이는 화분 함유량 중 glucose 량과의 관계로 해석된다(김, 1986).

메밀화분의 아미노산 조성을 분석한 결과는 Fig. 1에서와 같이 glutamic acid 등 18종의 아미노산이 존재하며, 특히 phenylalanine, leucine, threonine, lysine, valine, tryptophan, isoleucine, methionine 등 필수아미노산 8종을 모두 함유하고 있다. 함량은 glutamic acid 2.196%, aspartic acid 1.370%, lysine 1.091% 순이었으며, tryptophan, cystine, tyrosine, methionine, histidine 등은 소량 존재하였다. 도토리화분과 다래화분의 아미노산 조성은 aspartic acid, glutamic acid, leucine, lysine 순으로 분포하며(이 등, 1997; 홍 등, 2013b), 송화분은 aspartic acid, glutamic acid, arginine(한 등, 2004), 족제비싸리화분과 해바라기화분은 glutamic acid, aspartic acid, proline 순으로 분포하였다(Hong et al., 2016; 윤 등, 1985). 벌화분에는 glutamic acid와 aspartic acid 아미노산이 공통적으로 많이 존재하며, 메밀화분에는 lysine, 도토리화분과 다래화분에는 leucine, 송화분에는 arginine, 족제비싸리화분과 해바라기화분, 벼화분에는 proline이 많이 함유되어 있다. 또한 cystine, histidine, methionine 등의 아미노산은 모든 화분에 소량 존재하였다. 메밀화분에는 glutamic acid, aspartic acid, lysine, leucine, arginine, proline 등 6종의 아미노산이 총 아미노산 함량의 56%로 Solberg and Remedios(1980) 등이 보고한 60%와 유사한 결과이다. 일반적으로 화분에는 모든 필수아미노산을 함유하고 있으며 함량은 식물의 종에 따라 차이가 있다(Leblanc et al., 2009).

Fig. 1. 
Content of amino acid composition in buckwheat pollen grains. IIe; isoleucine, Leu; leucine, Lys; lysine, Met; methionine, Phe; Phenylalanine, Thr; Threonine, Ttp; tryptophan, Val; valine, His; histidine, Ala; alanine, Arg; Arginine, Asp; aspartic avid, Glu; glutamic acid, Gly; glycine, Ser; serine, Cys; cysteine, Tyr; tyrosine, Pro; proline.

메밀화분의 비타민 함량은 Table 5에서와 같이 비타민 C, B₃, B₁, B₂ 순으로 분포하였다. 메밀화분의 비타민 C의 함량 13.74mg/100g은 송화분(2.25mg/100g)과 벼화분(0.6mg/100g)보다 많았으나 족제비싸리화분(57.81mg/100g)과 다래화분(48.44mg/100g)보다 적었다. 메밀화분의 비타민 B₃ 함량 6.62mg/100g은 벼화분(4.28mg/100g) 보다 많았으나 다래화분(21.0mg/100g)보다 적었다. 메밀화분의 비타민 B₂ 함량 0.53mg/100g은 송화분 (7.93mg/100g)보다 적었으나 족제비싸리화분 (0.87mg/100g)과 유사하였으며 벼화분(0.69mg/100g)보다 많았다(한 등, 2004; 홍 등, 2016; Hong et al., 2016; Hong et al., 2015). 즉 벌화분의 비타민 함량은 메밀화분과 도토리화분, 다래화분에는 비타민 C, 벼화분에는 비타민 B₃, 송화분은 B₂ 함량이 가장 많이 분포하였다.

메밀화분의 대표적인 10종 미량원소 함량을 분석한 결과는 Table 6과 같다. 분석한 10종의 미량원소 중 칼륨(K) 1197.95mg/100g과 인(P) 962.77mg/100g, 마그네슘(Mg) 535.42mg/100g 순으로 가장 많이 함유되어 있으며, 구리(Cu)와 아연 (Zn)이 각각 0.46mg/100g, 1.59mg/100g으로 적게 함유되어 있었다. 족제비싸리화분과 송화분, 벼화분에서는 칼륨(K) 함량이 가장 많았으며 철분(Fe) 가장 적게 함유되어 있었다(Hong et al., 2016; 한 등, 2004; 홍 등, 2016). 즉 벌화분의 미량 원소 함량은 메밀화분과 송화분에는 칼륨, 인, 마그네슘 순으로, 벼화분과 족제비싸리화분은 칼륨, 인, 칼슘 순으로 많이 분포하였다. 화분의 미량원소는 밀원의 식생에 따라 다양하게 분포하며(Stanley and Linskens, 1974). 메밀화분의 K/Na 비는 123.3으로 도토리화분 12.59과 벼화분 31.93, 족제비싸리화분 44.03보다 높았다(이 등, 1997; 홍 등, 2016; Hong et al., 2016). 화분의 K/Na 비는 벌 먹이의 주요한 요인으로 작용한다(Wesh & Marston, 1983).

메밀화분의 항산화 활성과 총페놀함량을 분석한 결과는 Table 7과와 같다. 메밀화분의 자유라디칼소 거능에 대한 항산화 활성은 추출물 500μg/ml에서 8.1%이었으며, 총페놀함량은 mg당 2.25μg이었다. 이는 벼화분의 항산화 활성과 총페놀함량 보다 낮은 결과이다(홍 등, 2016). DPPH radical 소거능은 산화작용에 의하여 발생하는 hydroxyl radical, superoxide radical 등을 제거하는 항산화 능력을 평가할 때 가장 널리 이용되는 지표이다(김 등, 2000; 이 등, 2011). 항산화 효과는 페놀 또는 플라보노이드 함량이 많을수록 높은 것으로 알려져 있으며(Kim et al., 2015), 항산화 활성은 폴리페놀성 물질의 수산기를 통한 수소 공여와 페놀 고리구조의 공명구조 안정화로 인하여 나타낸다고 알려져 있다(이 등, 2009).