오프라인 시장에서 유통되고 있는 2021년에 생산된 다래 화분을 구매한 다음 밝고 진한 노란색의 색상을 나타내는 화분을 분류하여 -20℃에서 냉동 보관하면서 분석에 이용하였다. 모든 시약은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)에서 시약급 이상의 제품을 구매하여 분석에 사용하였다.

화분 추출물은 시료 3 g에 대해 70% 에탄올 10배를 가한 후 sonicator (Branson 8510, Emerson Electric Co., Ltd., USA)를 이용하여 1시간 동안 추출하여 여과지 (filter paper No. 2, Whatman, UK)로 여과하는 과정을 3회 반복하였다. 추출물은 감압 농축기 (eyela Rotary evaporator N-1200, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Japan)를 이용하여 conical tube에 농축하여 분석 시료로 본 실험에 사용하였다.

화분의 외관은 현미경 (evos XL Core microscope, Thermo Fisher Scientific, MA, USA, ×200)으로 확인하였으며, 화분의 형태는 주사전자현미경 (emission-scanning electron microscope, SEM, S-2460N, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다. 유전자 분석은 Amplicon read를 이용한 metagenome 분석은 Qiime (release 2022.08)으로 분석하였다.

본 연구에 사용된 전립선암 LNCaP 세포주는 한국세포주은행에서 보관 중인 세포를 분양받아 계대 배양하여 사용하였다. LNCaP 세포는 Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI-1640; Gibco, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS; GenDEPOT, Korea)과 100 unit/ml의 penicillin-streptomycin 항생제 용액 (Gibco, USA)을 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

LNCaP 세포에 대한 독성을 평가하기 위해 각 시약을 농도별로 세포에 처리한 후 EZ-Cytox 평가법을 실시하였다 (Park et al., 2008). 세포를 96-well plate에 2×10⁴ cells/well이 되도록 분주한 뒤, 24시간 동안 배양시켰다. 배양된 세포에 다래 화분을 농도 의존적으로 처리하였다 (100 μg/ml, 200 μg/ml, 500 μg/ml). 이때, 대조구로서 아무것도 처리하지 않은 세포와 추출물의 용매에 대한 대조구로서 DMSO가 포함된 배지를 처리한 세포를 설정하였다. 배지의 1/10 부피로 시약을 처리한 후 2시간 동안 배양기에서 반응시켰고, 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 나타내었다. 정상 세포 독성 평가는 피부각질세포주 (HaCaT)를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 실험하여 세포 생존율을 나타내었다.

다래 화분 추출물에 의한 항암 기전을 확인하고자 Western blotting을 실시하였다 (Kim et al., 2019). 100 mm cell culture plate에 세포를 접종하고, 다래 화분 추출물을 100 μg/ml, 200 μg/ml, 500 μg/ml 농도로 처리하였다. 추출물을 처리한 세포를 24시간 후에 회수하고 원심분리하여 배양액을 제거한 세포만을 수거하였다. 수거한 세포를 1×phosphate buffered saline (PBS)로 3회 정도 세척한 후 lysis buffer를 첨가하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하고, 단백질이 용출된 상층액을 회수하여 분석에 이용하였다. 모든 시료의 단백질 양을 동일하게 실험에 적용하기 위해 bicinchronic acid (BCA, GenDEPOT) 단백질 정량법으로 농도를 측정한 후 정량된 단백질을 Western blotting에 사용하였다. 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 전개된 단백질을 PVDF membrane에 transter한 후, 세포 내의 단백질 변화를 확인하고자 1차 항체로는 AIF, Annexin V, Bak, Bax, Akt, Bcl-2, 그리고 PCNA를 각각 1 : 1,000의 희석 배율로 2% nonfat dry milk에 희석하여 overnight 반응시켰으며, GAPDH는 1 : 5,000으로 희석하여 동일하게 overnight 반응시켜 분석에 사용된 단백질이 모두 동일하게 사용되었음을 나타내는 실험 대조구로 사용하였다. 1차 antibody 반응 후 각 antibody의 특이성에 맞춰 2차 antibody를 1시간 동안 반응시켰고, ECL pico detection system (GenDepot)으로 발색한 후 GelDoc으로 각 protein band 단백질 발현량을 분석하였다.

본 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 통계 분석은 SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 분산 분석 (ANOVA)를 실시하였으며, 시료 간의 유의성은 Duncan’s multiple range test로 차이를 검정하였다 (p<0.05).

서양종 꿀벌이 수집한 다래 화분의 형태적 특성은 Fig. 1에서 나타내었다. 본 연구에서는 서양종 꿀벌이 다래 화분을 경단처럼 알갱이 형태로 뭉친 상태의 다래 화분을 수집하여 시료로 사용하였다 (Fig. 1A). 화분은 크기, 모양, 발아구의 형태 등 식물의 형태에 따라 유연관계를 파악할 수 있으며, 다양한 정보를 보유하고 있어 식물 분류 연구에 있어 중요하다 (Lee, 1984). 다래 화분을 광학현미경 (Fig. 1B)과 주사전자현미경을 확인한 결과 (Fig. 1C), 아장구형 (subprolate) 모양과 단립 형태이며, 극면상이 원형을 띠고 있는 형상이다. 발아구는 3구형이며 표면에는 극히 미세한 돌기와 구멍이 존재한다고 보고한 선행 연구 (Hong et al., 2013)와 본 연구에 사용된 다래 화분과의 형태학적 일치함을 확인할 수 있었다. 또한 유전자 분석 (metagenome) 결과를 통해 Actinidia arguta 85%, Amorpha spp. 14%로 다래 화분으로의 밀원 동정을 확인하였다.

Fig. 1. 
Morphology of the darae pollen (Actinidia arguta).

다래 화분 추출물의 LNCaP 세포주 이용 세포 독성 평가는 MTT assay를 응용한 EZ-cytox detection system으로 확인하였다 (Fig. 2). 세포를 96-well plate에 접종한 후 24시간 경과 후 다래 화분 추출물을 농도 의존적으로 처리하였다. 세포에 처리한 농도는 100, 200, 500 μg/ml로 처리하였으며 다래 화분 추출물 농도가 증가할수록 세포 증식이 감소하였다. 다래 화분 추출물의 가장 높은 처리 농도 (500 μg/ml)에서 다래 화분 추출물에서 30% 이상의 세포 독성을 관찰하며 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 또한 다래 화분 추출물의 정상 세포 독성 평가를 확인하고자 피부 각질 세포주 (HaCaT)를 이용한 세포 독성 평가한 결과 (Fig. 3)에 따르면 다래 화분 추출물의 모든 농도를 정상 세포에 처리할 때 세포 독성이 관찰되지 않았으며, 이는 다래 화분 추출물이 정상 세포는 죽이지 않고 암세포에서만 선택적 항암 활성 효과가 있음을 확인하였다.

Fig. 2. 
LNCaP cell viability of the Darae pollen. Error bars represent the standard deviation of the mean and different letters indicate significant difference (p<0.05). LNCaP cells were incubated with complete medium containing Darae pollen extracts. Darae pollen extracts were treated with dose-dependent (100, 200, 500 μg/ml) on LNCaP cells for 24 hr.

Fig. 3. 
HaCaT cell viability of the darae pollen. HaCaT cells were incubated with complete medium containing Darae pollen extracts. Darae pollen extracts were treated with dose-dependent (100, 200, 500 μg/ml) on HaCaT cells for 24 hr.

다래 화분 추출물이 전립선 암세포 내의 단백질 분자 발현에 끼치는 영향을 확인하고자 Western blotting을 통해 확인하였다 (Fig. 4). 단백질 발현을 확인한 단백질은 두 가지의 group으로 나누었는데, 한 group은 세포 사멸에 직접적으로 영향을 끼치는 단백질이고, 다른 group은 세포 분열을 촉진시키는 단백질로 구성하였다. 세포 사멸 촉진에 관련된 단백질은 AIF, Annexin V, Bak와 Bax이며 세포 분열 촉진에 관련된 단백질은 Akt, Bcl-2와 PCNA이다 (Yun et al., 2006; Kim et al., 2008). 본 연구 결과, 세포 사멸 관련 단백질 중 Bak를 제외하고 단백질 발현량은 화분 추출물의 농도 의존적으로 증가하는 양상을 보였다. 세포 사멸과 관련된 단백질 중 AIF의 증가가 나타났으며, 이는 미토콘드리아 내의 AIF가 세포질로 방출되어 양이 늘어나 이로 인해 세포 사멸 개시로 이어진 것으로 보인다 (Debatin, 2004). Annexin V도 마찬가지로 세포 사멸이 시작되면서 세포에 결합된 양이 늘어난 양상을 보였다. 다만, Bak의 경우는 변화가 없으나 Bax의 양이 늘어난 것으로 확인되었다. 이는 다래 화분 추출물이 Bax를 활성화하는 것으로 보인다. 세포 분열 단백질 발현 결과를 보았을 때, 세포 분열에 직접적으로 관여하는 Akt의 양이 줄어든 양상을 보였으며 Bcl-2 단백질 역시 화분 추출물의 농도 의존적으로 단백질 발현량이 줄어든 것을 확인하였다. 대표적인 세포 분열 촉진 단백질인 PCNA도 마찬가지로 줄어든 양상을 보였다. 결과적으로 세포 사멸 단백질은 발현량이 증가하고 세포 분열 촉진 단백질 발현량은 줄어드는 양상을 확인하였다. 이를 통해 다래 화분 추출물이 전립선 비대증 또는 전립선암에 대해 효과가 있음을 확인하였고, 특히 이 과정은 세포 내의 AIF 사멸 경로로 이어지게 됨을 알 수 있었다. GAPDH는 본 연구의 Western blotting 실험에 있어 단백질 발현량이 동일한 양으로 분석되었다는 loading control 역할로 사용하였다.

Fig. 4. 
Cell proloferation and apoptosis related protein expression effect of darae pollen extracts (100, 200, 500 μg/ml). All of antibodies were diluted in 2% skim milk at 1 : 1,000 except GAPDH (1 : 5,000). GAPDH was housekeeping control for western blotting.