꿀벌의 인공수정을 위하여 예천군곤충연구소 꿀벌육종연구센터 (36°49′37″N, 128°27′24″E)에서 사양관리하는 양봉꿀벌 (Apis mellifera) 봉군을 사용하였다. 여왕벌 인공수정은 2017~2021년까지 5년 동안 4~8월 중에 수행하였다. 산란율 조사를 위하여 2017년 108마리, 2018년 129마리, 2019년 144마리, 2020년 85마리, 2021년 138마리의 인공수정된 여왕벌이 사용되었다.

꿀벌의 인공수정 전 여왕벌 및 수벌양성은 곤충의 인공수정법 (RDA, 2008)을 기준으로 수행하였다. 먼저 인공수정에 사용할 여왕벌을 생산하기 위하여 다음과 같은 순서로 ‘여왕벌 양성봉군’을 만들었다. ① 양봉장에서 세력이 가장 좋은 봉군을 선택하여 벌통 내 소비 (벌집)를 10장으로 만든다. 봉군의 세력은 소비 1장당 벌의 수를 1500~1700마리 (소비에 붙을 수 있는 최대치의 벌의 70~80%) 정도로 조성한다. ② 계상 벌통 (2층으로 된 벌통)을 준비하여 1층에는 여왕벌을 포함한 6장의 소비, 2층에는 여왕벌이 없는 4장의 소비를 배치한다. ③ 1층의 여왕벌이 2층에 올라가지 못하도록 1층과 2층 벌통 사이에 ‘수평격왕판’ (Bamboo Queen Excluder, YASEANG Corp., Gwangju, Korea)을 설치한다. 여왕벌 양성봉군이 준비된 이후 여왕벌 생산을 위한 이충작업 (Grafting)을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 이충왕완틀 (Queen Cell Bar Frame, Main trade corp., Yangpyeong, Korea)에 일정한 간격으로 40개의 왕완 (Queen cell, YASEANG Corp., Gwangju, Korea)을 붙인 후, 이충침 (Queen grafting tool, YASEANG Corp., Gwangju, Korea)을 이용하여 왕완 내부에 인공수정시키고자 하는 계통의 1령 유충을 옮겨 주었다. 총 40마리의 이충을 완료한 후 ‘왕완틀’은 여왕벌 양성봉군의 2층 벌통에 삽입하였다. 그 이후 당액 (설탕 1.5 : 물 1)과 대용화분 (Premium Bee patty, Korean beekeeping cooperatives, Seoul, Korea)을 인위적으로 공급하였다. 이충 12일 후 우화 전 처녀 여왕벌이 들어있는 왕완을 떼어내 ‘왕롱’ (Queenbee Isolation Case, YASEANG Corp., Gwangju, Korea)에 담아 여왕벌 양성봉군 안에 넣어 보관하였다. 왕롱 보관 48시간 후 여왕벌 우화를 확인한 후 왕완을 제거하고 우화한 여왕벌만을 다시 왕롱에 넣어 여왕벌 양성벌통에 재투입한 후, 인공수정 전까지 보관하였다. 인공수정 여왕벌은 우화 5일부터 16일까지의 벌을 사용하였다 (Cobey, 2007).

인공수정을 위한 수벌 양성을 위하여 여왕벌 양성봉군과 같은 방법으로 1층 벌집만을 사용하여 ‘수벌 양성봉군’을 조성하였다. 조성된 봉군에 봄철에 제작된 수벌 소비를 삽입하고 3일 후 산란 확인을 하였다. 산란 확인 24일 후부터 매일 우화한 수벌을 확인하여 가슴에 유성펜으로 마킹하였다. 인공수정에는 우화 12일째 되는 벌을 선별하여 사용하였다 (Ruttner, 1988; Cobey, 2007).

인공수정은 ‘꿀벌 인공수정기’ (Schley Instrumental Insemination 1:02 Set, Schley Instrumental Insemination, Ger- many)를 사용하여 ① 수벌정액 채취, ② 여왕벌 고정, ③ 정액주입 순서로 수행되었다 (Cobey et al., 2013; Fig. 1).

Fig. 1.  
Procedure for instrumental insemination in honeybee.

먼저 수벌의 정자를 확보하기 위하여 수벌 양성봉군에서 선별된 수벌의 복부 아래쪽을 손가락으로 압박하여 정소를 노출시킨 후 인공수정주사기로 채취하였다. 여왕벌은 외부 환경의 영향을 막기 위해서 여왕벌 양성봉군에서 인공수정실까지 사각통 (M700 Slidefile, Simport, Quebec, Canada)에 넣어 이동하였다. 여왕벌 고정은 탄산가스 처리와 동시에 이루어졌으며 인공수정기기에 여왕벌 배면과 침이 있는 부분이 수평이 되게 하여 여왕벌 생식기에 수벌 정액 10 μL를 주입하였다. 두 번째 교미 방지를 위해 인공수정 후 여왕벌의 날개 한 쪽을 가위로 1/3 정도 잘라내었다. 또한 여왕벌을 빠르게 확인하기 위해 여왕벌 가슴에 매니큐어를 칠하여 표시하였다. 처리가 끝난 여왕벌은 왕롱에 넣고 사각통에 담아 이동하여 여왕벌 양성봉군에 넣어 보관하였다. 24시간 후 왕롱에서 여왕벌을 꺼내 탄산가스로 20초 마취 후 여왕벌 양성 벌통에 재투입하였다.

인공수정된 여왕벌의 산란을 위해 스티로폼 벌통 (Styrofoam beehive, YASEANG Corp., Gwangju, Korea)을 준비하여 내역봉 (nurse bee)이 양성된 소비 1장과, 꿀이 저장된 소비 1장을 삽입하여 ‘산란유도봉군’을 조성하였다. 다음으로 여왕벌 양성봉군에 재투입 후 24시간이 지난 인공수정된 여왕벌을 철망 (8 cm×8 cm×1.5 cm, 자체 제작)에 넣어서 산란유도봉군에 유입시켰다. 인공수정 여왕벌 유입 48시간 이후 철망을 제거하였다. 그 이후 인공수정 여왕벌의 2차 교미 및 유실을 방지하기 위해 ‘격왕판’의 일부를 잘라 벌통 출입구에 설치하여 여왕벌의 외부 이동을 통제하였다. 철망 제거 후 5일째부터 봉군 내 여왕벌 산란이 확인되었을 때 여왕벌 외부이동 통제를 해제하였다.

각 여왕벌 양성봉군의 이충성공률 (여왕벌 생산성공 비율)에 따른 인공수정 여왕벌의 산란성을 확인하기 위하여, 31개의 여왕벌 양성봉군으로부터 생산된 인공수정 여왕벌의 산란율을 조사하였다. 이충성공률은 각 여왕벌 생산봉군에서 이충된 왕완의 수로부터 우화된 여왕벌의 수를 백분율로 나타내었다.

Grafting success rate%=Number of bees emerging from queen cellsNumber of queen larvae grafted into queen cells×100

산란율은 각 이충성공률이 계산된 여왕벌 생산봉군으로부터 인공수정된 여왕벌의 수에서 산란에 성공한 여왕벌의 수를 백분율로 계산하였다.

Ovipositing success rate%=Number of ovipositing from queen beesNumber of instrumental inseminated queen bees×100

이충성공률과 산란율 간의 관계를 확인하기 위해 상관분석을 수행하였고, 유의미한 상관이 확인 시 회귀분석을 통하여 관계식을 도출하였다.

여왕벌의 나이에 따른 여왕벌의 산란 효과를 비교하기 위하여, 새로 우화한 여왕벌을 대상으로 우화 후 6일 40마리, 8일 75마리, 10일 42마리, 12일 32마리, 14일 13마리, 16일 18마리의 여왕벌을 확보한 후 인공수정을 수행하였다. 각 나이에 인공수정된 여왕벌의 산란율을 확인하여 가장 효과적인 여왕벌의 연령을 확인하였다. 또한 산란에 성공한 여왕벌을 대상으로 여왕벌의 인공수정일로부터 여왕벌의 첫산란일까지 소요된 일수를 계산하여 각 나이별로 비교하였다.

인공수정의 적정한 시기를 확인하기 위하여 5년 동안 4월부터 8월까지 각 월별 인공수정된 여왕벌의 산란율과 첫산란소요일수를 비교하였다. 또한 월별 기상환경의 차이가 있는지 확인하기 위하여 양봉장 주변의 경북지방기상청 안동기상대 (36°87′18.3″N, 128°51′68.7″E)의 각 월별 기상데이터 (기온, 습도, 풍속)를 기상청 자료개방포털 사이트 (KMA, 2023)에서 확보하였다.

여왕벌 양성봉군의 이충성공률과 그 봉군에서 인공수정된 여왕벌의 산란과의 상관관계는 Pearson correlation으로 분석하였다. 유의성이 확인되면 1차 선형 회귀분석을 진행하였다. 회귀모델은 ANOVA test를 통한 검정하고 Durbin-Watson test을 통하여 도출된 회귀식의 자기상관을 확인하였다. 여왕벌 나이에 따른 산란율의 차이는 각 나이별 인공수정된 벌의 수가 달라 단반복으로 비모수 검정인 Chi-square test로 유의성을 확인하였다. 평균비교 데이터는 Shaprio wilks test를 통한 정규성 검정과 함께 히스토그램을 작성하여 정규분포인지 확인하였다. 여왕벌 나이별 첫산란소요일수와 인공수정 시기별 산란율과 첫산란소요일수의 차이, 월별 기상정보는 정규성 검정에 따라 oneway ANOVA test를 수행하였고, Leven F 검정으로 등분산이 만족하지 않을 경우 welch’s ANOVA를 수행하여 유의성을 검정하였다. 평균을 통한 유의성 검정된 모든 데이터는 Turkey’s HSD로 사후검정하였다. 본 연구의 통계분석은 SPSS PASW 26.0 for windows 통계 패키지 (IBM, Chicago, USA)를 사용하였다.

각 여왕벌 생산봉군으로부터 여왕벌의 이충성공률을 조사한 결과 2017년 64.8±9.9%, 2018년 76.8±9.3%, 2019년 43.2±24.2%, 2020년 53.8±14.1%, 2021년 78.6±11.4%로 나타났으며, 같은 해 여왕벌의 산란율은 각각 64.8±9.9%, 77.3±8.8%, 39.0±28.7%, 52.3±7.7%, 44.4±10.0%로 조사되었다 (Table 1). 이충성공률과 여왕 벌의 산란율에 대한 상관관계를 확인한 결과, 유의미한 정의 상관이 확인되었다 (Pearson correlation r=0.588, p= 0.0001). 이에 따라 이충성공률과 산란율 간 회귀분석을 수행한 결과 (Fig. 2), 유의미한 1차 회귀식이 유도되었다 (R²=0.346, model ANOVA F_1,29=15.327, p=0.001, DW=1.44, y=0.6249x+17.227). 따라서 이충성공률이 높은 여왕벌 양성봉군에서 확보된 여왕벌일수록 높은 산란율을 기대할 수 있다. 꿀벌의 인공수정에 영향을 미치는 요인 중 하나는 건강한 여왕벌이다 (Khan et al., 2022). 이충 작업 후 여왕벌의 발육은 양질의 먹이 공급과 내역봉의 수나 질 등 봉군의 상태에 따라 달라질 수 있다 (Woyke, 1971; Gencer et al., 2000; Tarpy et al., 2000). 이충성공률이 높다는 것은 곧 봉군이 여왕벌을 양육할 수 있는 능력이 높다는 것으로 양질의 여왕벌이 생산될 수 있는 가능성도 높아질 수 있다 (Dedej et al., 1998; Cobey, 2007). 그러나 도출된 회귀식의 설명력이 0.346으로 높지 않아 이충성공률만으로 인공수정의 성공률 곧 산란율을 예측하기는 어렵다. 이는 교미 당시의 여왕벌 컨디션, 정자의 질, 유입된 봉군의 건강상태, 당시 기상조건 등 야외의 꿀벌이 사양되는 현장에서 여왕벌의 산란에 영향을 미치는 변수가 다양하기 때문이라고 생각된다 (Shehata et al., 1981; Szabo et al., 1987; Hatch et al., 1999; Skowronek et al., 2002). 그럼에도 불구하고, 이러한 결과는 5년간의 인공수정 현장 데이터로부터 유의미한 회귀모델이 도출되었기 때문에 인공수정 시 여왕벌을 선발할 때의 조건으로 충분히 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

Fig. 2.  
Regression analysis between grafting success rate in bee hives and ovipositing success rate in inseminated queen bees. The dashed line represents the trendline based on the first-order regression equation. Regression equation: y=0.6249x+17.227, model ANOVA F_1,29=15.327, p=0.001, DW=1.44.

인공수정에 가장 적합한 여왕벌의 나이를 확인하기 위하여, 우화 후 여왕벌 나이 6일, 8일, 10일, 12일, 14일, 16일에서 각각 인공수정한 여왕벌의 산란율을 조사한 결과 (Fig. 3), 각각 50%, 44%, 52.4%, 75%, 92.3%, 94.4%로 우화 후 12일에서 16일 된 여왕벌의 산란율이 가장 높았다 (chi-square test: x72=39.303, p=0.0001; Fig. 3). 여왕벌 나이에 따른 첫산란소요일수를 조사한 결과 (Fig. 4), 여왕벌 나이 6일, 8일, 10일, 12일, 14일, 16일 때, 첫산란소요일수는 각각 14.5±5.6일, 14.8±7.7일, 11.6±7.2일, 8.5±2.8일, 8.2±2.6일, 10.8±4.7일로 여왕벌의 나이에 따른 첫산란소요일수는 12일과 14일에서 가장 짧은 결과를 보였다 (oneway ANOVA, F_5,120=4.987, p=0.0001). 여왕벌 나이는 인공수정 성공률에 결정적인 영향을 미치는 요소이다 (Cobey, 2017). 일반적으로 우화한 처녀여왕벌은 7~10일 안에 자연교미하며 교미 후 2~3일 안에 첫 산란을 시작한다 (Kim et al., 1996). 이번 결과는 자연교미를 하는 여왕벌의 연령보다 5~9일이 더 긴 12~16일령 여왕벌의 산란 성적이 더 뛰어난 것으로 나타났는데, 이는 인공수정 중 여왕벌 탄산가스 처리, 주사기 생식기 주입, 여왕벌 날개 제거 등과 같은 처리로 인하여 여왕벌이 생리적으로 영향을 받았기 때문으로 생각된다. 특히 탄산가스는 꿀벌의 체지방을 적게 발달시키며, 밀랍샘과 하인두샘을 억제하는 등 생리적 교란을 일으킬 수 있다 (Chuda-Mickiewicz et al., 2012). 인공수정된 여왕벌의 첫산란 시작시기는 인공수정 성공에 대한 주요지표로 많은 보고가 되었지만 시기는 매우 다양하다. Wilde (1994)는 인공수정 후 10~37일 이후에 첫산란이 일어난다고 보고하였고, Khan et al. (2022)은 6년간 인공수정 데이터에서 여왕벌의 67%가 6~10일 내에 첫 산란이 일어난다고 보고하였다. 여왕벌의 산란은 봉군의 구성 (Winston, 1987)이나 90% 이상 습도가 높거나 저온의 환경 (Skowronek et al., 2002) 등 다양한 요인에 의해 산란이 지연될 수 있기 때문에 산란속도의 직접적인 비교는 어렵다. 인공수정의 성공은 여왕의 산란능력인 번식력과 생존능력에 의존하기 때문에 (Khan et al., 2022), 첫 산란까지 소요되는 시간이 짧다는 것은 새로운 봉군에 여왕벌이 얼마나 빨리 적응하고, 새로운 형질의 후손생산이 빨리 이루어지는 것으로 해석할 수 있다. 이러한 결과를 종합할 때, 꿀벌 여왕벌의 인공수정을 위해 여왕벌 나이가 우화 후 12~16일의 여왕벌을 사용하는 것이 효과적일 것으로 생각된다.

Fig. 3.  
Ovipositing success rate of queen bees according to day since virgin queen energence. A statistically significant difference in oviposition success rates was observed based on the chi-square test (p<0.05).

Fig. 4.  
Day of first oviposition in queen bees according to days since virgin queen emergence. Error bars represent standard deviation values. Different letters indicate significant differences among days since virgin queen emergence, based on the results of one-way ANOVA and Tukey’s HSD (p<0.05).

4월에서 8월까지 월별로 인공수정된 여왕벌의 산란율을 조사한 결과 (Fig. 5), 7월 36.3±10.7%, 8월 40.2±3.2%는 4월 63.2±21.3%, 5월 64.0±21.4%, 6월 60.0±12.1%보다 20% 이상 낮은 산란율을 나타내었다 (welch’s ANOVA test: F_4,17=4.455, p=0.038). 월별 첫산란소요일수는 4월 13.8±3.9, 5월 11.8±2.6%, 6월 12.2±4.3, 7월 11.3±3.2, 8월 11.0±9.4일로 통계적인 차이가 확인되지 않았다 (one-way ANOVA test F_4,17=0.176, p=0.948; Fig. 6). 여왕벌의 산란은 기상환경과 계절조건에 영향을 받는다 (Woyke and Jasiński, 1990; Schlüns et al., 2005). 인공수정이 완료된 여왕벌은 야외에서 사양되고 있는 산란유도봉군에 유입시켜야 하기 때문에 외부 기상환경에 영향을 받을 가능성이 높다. 우리나라는 계절변화가 뚜렷하여, 시기에 따라서 평균온도, 평균습도 등이 차이가 크다 (Choi et al., 2006). 실제로 5년간 양봉장 주변 대구지방기상청 안동기상대에서 측정된 온도, 습도, 풍속데이터에서도 월별 유의미한 차이를 나타내었다 (평균온도: F_4,760=531.590, p=0.0001, 평균습도: F_4,760=124.471, p=0.0001, 평균풍속: F_4,760=74.291, p=0.0001; Table 2). 이번 결과에서 여름철 7월과 8월에 산란율이 낮은 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 고온다습한 기후나 먹이량이 부족한 무밀기로 인한 영향으로 볼 수 있다. 기상조건에 있어 Pettis et al. (2016)과 Rousseau et al. (2020)은 교미를 마친 여왕벌이 고온과 저온에 노출되었을 때 수정낭 내 정자의 생존력이 감소하여 산란에 영향을 미칠 수 있음을 보고하였다. 먹이 면에서는 봄철 유밀기인 4~6월보다 무밀기에 해당하기 때문에 외부로 유입되는 화분원의 질과 양에 따른 영향 (Crailsheim et al., 1992; Di Pasquale et al., 2013)으로 생각될 수도 있다. 특히 계절에 따른 꽃가루의 종류에 따라 유충의 먹이 조성이 달라질 수 있으며 (DeGrandi-Hoffman et al., 2018), Fine et al. (2018)은 다른 환경적인 요인이 통제된 상황에서 먹이 내 꽃가루의 조성을 달리하는 것만으로도 여왕벌의 산란에 영향을 미칠 수 있음을 밝혔다. 따라서 국내에서 인공수정에 적합한 시기는 인공수정 여왕벌 유입 후 산란이 효과적으로 일어날 수 있도록 4월에서 6월 내에 이루어져야 할 것으로 판단된다.

Fig. 5.  
Comparison of oviposition success rate in inseminated queen bees based on the timing of instrumental insemination. Error bars represent standard deviation values. Different letters indicate significant differences among the timing of instrumental insemination, as determined by the results of one-way ANOVA and Tukey’s HSD (p<0.05).

Fig. 6.  
Comparison of the day of first oviposition in inseminated queen bees based on the timing of instrumental insemination. Error bars represent standard deviation values. There were no significant differences among the timing of instrumental insemination (p> 0.05).