실험 재료로 사용한 꿀 혼합 프로폴리스는 대한민국 양봉농협에서 판매하고 있는 프로폴리스 추출물 50 mL (총 플라보노이드 함량 30 mg/g 이상)을 사탕무 사양꿀, 아까시꿀 그리고 밤꿀 500 g에 각각 첨가하고 2시간 동안 교반하여 제작하였다. 제작한 꿀 혼합 프로폴리스 5 mL에 80% 에탄올을 동량 혼합하여 vortex하고 여기에 멸균 증류수 10 mL을 첨가하여 vortex하였다 (최종 20% 에탄올을 포함하는 20 mL의 꿀 혼합 프로폴리스). 세포에 처리하기 위해 0.45 μm의 syringe filter에 여과하여 최종 시료를 준비하였다.

세포 배양에 사용된 Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), penicillin-streptomycin은 Gibco (U.S.A.)에서 구입하였으며, fetal bovine serum (FBS)은 GenDEPOT (Korea)에서 구입하였다. 세포에 자극을 주기 위한 LPS는 Sigma (U.S.A.)에서 구입하였으며, 단백질 추출에 사용된 Nonidet P-40 (NP-40) 완충액은 Invitrogen (U.S.A.)에서 구 입하였다. 세포 생존율을 측정하기 위한 EZ-Cytox Plus solution은 DoGenBio (Korea)에서 구입하였고, NO 생성 평가를 위한 NO assay kit는 iNtRON biotechnology (Korea)에서 구입하였다. Western blotting에 사용된 COX-2, NF-κB 그리고 GAPDH는 Santacruz Biotechnology (U.S.A.)에서 구입하였으며, HO-1, NRF-2는 Cell Signaling Technology (U.S.A.)에서 구입하였다. 또한 2차 항체로 사용한 goat anti-mouse-HRP와 goat anti-rabbit-HRP는 GenDEPOT에서 구입하였다.

실험에 사용한 mouse Raw264.7 대식세포는 한국세포주은행에서 구입하였으며, 세포 배양은 DMEM 배지에 100 unit/mL의 penicillin-streptomycin, 10%의 FBS가 첨가된 배지에서 배양하였다. 세포 배양은 37℃로 유지되면서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기에서 배양하였다.

Raw264.7 대식세포에 대해 시료가 가진 세포 독성 및 실험 농도 설정을 위해 꿀 혼합 프로폴리스를 세포에 처리하여 LD₅₀ 농도를 확인하였다. Raw264.7 세포는 96-well plate에 2×10⁴ cell/well의 수로 계수하여 분주하고 24시간 동안 배양시켰다.

SBH, AH, CH, SBHP, AHP 그리고 CHP를 각각 1, 3, 5, 10, 20, 30 그리고 50 μL/mL로 세포에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 24시간 동안 처리 후 EZ-cytox solution을 배지 부피의 1/10로 처리하고, 37℃ 세포 배양기에서 2시간 반응시킨 후 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 시험에 대한 대조구로서 배지만 있는 무처리구와 용매 대조구로 20% 에탄올을 처리한 세포를 비교하였다.

세포 독성 평가를 바탕으로 결정된 꿀 혼합 프로폴리스를 세포에 처리하여 (20 μL/mL) NO 생성에 대한 효과를 확인하였다. Raw264.7 대식세포를 12-well plate에 1×10⁵ cell/well로 접종하고 24시간 후 꿀과 꿀 혼합 프로폴리스를 처리하였다. 이들에 의해 생성되는 NO 양과 염증 반응 시에 생성되는 NO 양의 상대적인 비교를 위해 1 μg/mL의 lipopolysaccharide (LPS)만을 처리한 실험 그룹을 추가하였다. Fig. 1에 실험 조건을 도식화하였다.

Fig. 1.  
The condition of cell treatment for NO assay.

24시간 반응 후 배양액을 8,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액을 회수한 뒤, iNtRON (Korea)의 NO Assay kit를 사용하여 생성된 NO 양을 측정하였다.

NO 평가에서 회수된 세포에 NP-40 lysis buffer를 처리하고 단백질을 추출하였다. Cell scraper를 이용하여 세포를 완전히 용해한 뒤, 17,000 rpm에서 20분간 원심분리 후 상층액을 회수하였다. 추출된 단백질은 bicinchronic acid (BCA) 단백질 정량법으로 정량하고, 20 μg의 단백질을 4~15% gradient gel에 전개하였다. 전개된 단백질은 transblot unit (Bio-Rad, U.S.A.)을 이용하여 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 transfer하고, 항체의 비특이적 반응을 차단하기 위해 2% non-fat dry milk로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1차 항체는 COX-2 (1 : 5,000), NF-κB (1 : 500), HO-1 (1 : 3,000), NRF-2 (1 : 1,000), 그리고 GAPDH (1 : 5,000)를 2% non-fat dry milk에 각각 희석한 뒤, 실온에서 16시간 동안 반응시켰다. 이후 1× trisbuffered saline-tween-20 (TBS-T) 용액으로 membrane을 4회 수세하고, 1차 항체 생산 host에 맞춰 goat anti-rabbit-HRP 또한 goat anti-mouse-HRP를 1 : 2,000으로 5% non-fat dry milk에 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 1× TBS-T 용액으로 membrane을 4회 수세한 후, ECL pico detection system (GenDEPOT, Korea)으로 발색 후, ChemiDOC (Bio-Rad, U.S.A.) 장치에서 단백질 띠를 검출하였다.

제작된 꿀 혼합 프로폴리스의 세포 적정 처리 농도를 설정하기 위해 세포 독성 평가를 실시하였다. 프로폴리스, SBH, SBHP, AH, AHP, CH, CHP를 Raw264.7 대식세포에 처리하고 24시간 후 세포 독성을 측정한 결과, 무처리구와 에탄올 처리구에서는 세포 독성이 나타나지 않았으나 프로폴리스만을 단독으로 처리한 경우, 20 μL/mL 조건에서 약 60%의 세포 생존을 나타냈다. SBH와 AH에서는 세포 독성이 나타나지 않았으나, CH에서는 50 μL/mL로 처리하였을 때 세포 독성이 나타났다. 그러나 프로폴리스가 혼합된 SBHP, AHP, CHP는 20 μL/mL의 조건에서 모두 60% 정도의 세포 생존율을 나타냈다 (Fig. 2). 이는 꿀과 프로폴리스가 혼합되면서 첨가된 프로폴리스에 의해 나타난 세포 독성을 의미하며, 본 결과에 의해 세포에 처리할 LD₅₀ 농도는 20 μL/mL의 조건으로 설정하였다.

Fig. 2.  
Cytotoxicity effect of various honey and honey mixed with propolis. Volume-dependent propolis, SBH, AH, CH, SBHP, AHP and CHP treated to Raw264.7 for 24 hr. After incubation, add the EZ-cytox solution with 1/10 volume of media. Measurement of optical density at 450 nm.

SBH, AH, CH, SBHP, AHP, CHP의 처리에 의해 나타나는 면역 반응을 확인하기 위해 우선 NO 분자 생성을 평가하였다. 제작한 시료를 Raw264.7 대식세포에 처리하여 24시간 반응시키고 상층액을 회수하여 생성된 NO 분자의 양을 ELISA로 측정하였다. Fig. 3의 결과를 보면 LPS에 의한 염증 반응으로 생성되는 NO 양과 비교해볼 때, 프로폴리스와 SBH, AH, SBHP, AHP에 의해서는 대조구와 비슷한 수준의 NO 생성을 나타냈다. 그러나 CH의 경우 LPS로 인한 NO 생성에 비해 약 50% 수준의 NO를 발생시켰으며, CHP의 경우에는 다시 대조구와 비슷한 수준의 NO 생성을 나타냈다. 이는 순수 CH에 의해서는 세포에서 NO 생성을 발생시키지만 CHP의 경우 혼합된 프로폴리스에 의해 NO 생성이 억제됨을 나타낸다.

Fig. 3.  
NO assay with various honey and honey mixed with propolis. 1 μg/mL of LPS and 20 μL/mL of various honey and honey mixed with propolis were incubated for 24 hr. NO assay performed followed manufacture’s protocol. Optical density measured at 540 nm.

꿀 혼합 프로폴리스에 의한 대식세포 내 면역관련 분자에 대한 발현을 확인하기 위해 Western blotting을 실시하였다 (Fig. 4). COX-2의 경우 특이하게 프로폴리스, SBH, AH, SBHP, AHP가 처리된 세포에서는 발현을 검출되지 않았으나, CH를 처리한 세포에서 강한 발현을 나타냈으며, CHP의 경우에는 프로폴리스의 혼합으로 인해 COX-2의 발현이 감소된 것이 나타났다. 이는 CH로 인한 대식세포의 활성화를 의미하며, 동시에 염증 활성을 보이는 것을 의미한다. 그러나 CHP의 경우에는 프로폴리스의 염증 저해 활성으로 감소된 것을 의미한다. NF-κB의 경우에도 CH가 처리된 세포에서는 50 kDa의 단백질이 다른 시료에 비해 높은 발현을 나타냈으며, CHP는 프로폴리스로 인해 발현이 감소되었다. 세포 내 항산화와 관련된 주요 분자인 HO-1의 경우 다른 시료에서는 발현 증가가 나타나지 않았으나 AHP와 CHP에서 발현이 증가되었고, 특히 CHP에서 높은 발현 수준을 나타냈다. 특이하게도 SBHP에서는 발현 증가가 나타나지 않았는데, 이는 사양꿀과 천연꿀에 의한 차이로 보여지며, 천연꿀과 프로폴리스가 혼합되었을 경우에만 높은 발현을 나타냈다. 즉, 천연꿀과 프로폴리스가 혼합되었을 때에만 세포 자체의 항산화 활성을 증가시킨다는 것을 알 수 있다. HO-1 발현을 조절하는 것으로 알려진 NRF-2의 경우 HO-1이 증가된 AHP와 CHP에서 발현이 증가되었고, 이는 HO-1의 신호 전달 과정을 AHP와 CHP에 의해 조절되고 있음을 의미한다.

Fig. 4.  
AHP and CHP increased antioxidant-related HO-1 expression. 20 μg of protein resolved 4~15% gredient gel. All antibodies diluted in 2% non-fat dry milk and its dilution ratio was described at “Material and Method”.

꿀과 프로폴리스의 면역 관련 기능성은 현재까지 수많은 연구가 진행되고 있으며, 특히 항산화와 관련된 연구가 많이 이루어지고 있다. 기존 연구는 꿀 혹은 프로폴리스만 단독으로 사용하여 면역 조절에 대한 연구를 수행하였다 (Afrin et al., 2018; Kim et al., 2021). 그러나 본 연구에서는 꿀과 프로폴리스를 혼합함으로써 나타나는 세포의 면역 조절 분자의 발현에 대해 최초로 보고하며, 대표적인 양봉산물 두 종류를 혼합함으로써 나타나는 기능성 상승 효과에 대해 연구하였다. 특이한 점은 밤꿀과 프로폴리스를 혼합함으로써 세포의 면역 활성을 증가시키면서도 밤꿀에 의해 발생될 수 있는 염증성 부작용을 경감시킬 수 있는 효과적인 제형을 확인한 것이다. 또한 천연꿀에 해당하는 아까시꿀과 밤꿀 그리고 사탕무만으로 채취한 사탕무 사양꿀을 각각 프로폴리스와 혼합하여 HO-1 단백질 분자의 발현 차이를 검증함으로써 야생에서 채취되는 천연꿀의 중요성을 함께 보여주고 있다. 본 연구를 통해 프로폴리스를 꿀과 함께 혼합하여 섭취가 용이한 제형을 개발하였으며, 꿀의 종류에 따른 면역성 작용의 차이를 in vitro에서 입증하였고, 이와 함께 아까시꿀, 밤꿀 그리고 사탕무 사양꿀에 프로폴리스를 혼합하여 나타나는 면역 단백질 발현을 구명함으로써 천연꿀의 중요성을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 면역 조절에 대한 꿀과 혼합된 프로폴리스 제형의 상세한 기전을 밝힘으로써 건강기능식품으로서 가치를 높이고, 양봉산물의 활용이 널리 이루어질 것을 기대한다.