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염증(inflammation)은 물리적인 상처나 미생물에 감염되었을 때 손상된 조직을 재생하고 신체를 방어하기 위해 일어나는 선천성 면역(innate immunity)반응으로 알려져 있다(Medzhitov, 2008). 하지만 지속적인 염증반응은 제2형 당뇨나 자가면역질환 및 종양 등 각종 질환의 발병 요인으로 작용하기도 한다(Hofseth and Ying, 2006). 대식세포(macrophage)는 선천면역을 담당하는 주요세포로 LPS, 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)과 사이토카인 등에 의해 활성화되어 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β, IL-6 등의 염증성 사이토카인과 nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E₂ (PGE₂)와 같은 염증인자들의 생성에 관여한다(Akira et al., 2006). Nitric oxide synthase (NOS)는 neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS)와 inducible NOS (iNOS) 세 개의 isoform 형태로 존재한다. 그 중에서 iNOS는 interferon-γ, LPS 및 전염증성 사이토카인의 자극을 통해 L-arginine으로부터 nitric oxide (NO) 생성을 촉진시키는 효소로 알려져 있다(Guo et al., 2012).

NO는 free radical인 활성질소종(reactive nitrogen species: RNS)의 일종으로 superoxide 음이온(O₂^-)과 쉽게 반응하고 독성이 강한 산화제인 peroxynitrite (ONOO^-)를 생성하여 단백질 및 지질의 과산화를 유도하고 세포독성을 일으킨다(Radi et al., 1991). 따라서 NO 생성을 억제하는 천연물 소재는 항염증 치료제 개발을 위한 방편으로 관심이 높다고 할 수 있다.

최근 지구온난화로 인한 가축이나 어류 등의 생산량 감소로 인해 단백질 공급에 차질이 생길 것으로 예상된다.유엔식량농업기구(FAO)에서는 육류 대체품으로 곤충섭취를 대안으로 제시하였다(van Huis et al., 2013). 식용곤충은 식용을 목적으로 하는 곤충을 말하며 일반적으로 조단백질, 조지방, 식이섬유 및 비타민 등을 함유하고 있어 미래 식량자원으로 주목받고 있다(Bukkens, 1997). 현재 네덜란드, 덴마크를 중심으로 곤충식품을 식량자원으로 이용하기 위한 노력이 이루어지고 있으며 우리나라에서도 7종의 곤충(누에, 메뚜기, 백강잠, 갈색거저리 유충, 흰점박이꽃무지 유충, 장수풍뎅이 유충, 쌍별귀뚜라미)이 식품원료로 등록된 상황이다.

꿀벌 군집 가운데 수벌은 일벌과 달리 여왕벌과 교미하는 일 외에는 생산적 가치가 낮지만 수벌 번데기를 식품원료로 이용한다면 경제적 소득 및 식품 소재의 다양화 측면에서 중요한 자원이 될 수 있을 것으로 기대하고 있다. 최근 식품원료로 사용하기 위하여 수벌 번데기의 영양학적 측면과 유해미생물에 대한 안전성 등에 많은 연구가 활발히 진행되고 있다(Kim et al., 2018; Kim et al., 2019).

따라서 본 연구에서는 수벌 번데기에 대한 다양한 효능 구명을 통해 고부가가치 식품 소재로 활용하고자 수벌 번데기 메탄올 추출물을 이용하여 LPS로 활성화된 RAW264.7 세포에서 NO 억제 효과를 조사하였다.

수벌 번데기 건조분말 시료 100 g을 methanol로 추출한 후 감압농축하여 추출물 8.3 g (8.3%)을 얻었다. 그리고 여기서 얻어진 추출물 8.3 g을 증류수로 용해시킨 후에 hexane, ethyl acetate 및 butanol 순으로 분획하였다. 그 결과 hexane 분획물 2.3 g (27.71%), ethyl acetate 분획물 296 mg (3.56%), butanol 분획물 824 mg (9.92%) 및 물 분획물 3.29 g (39.63%)을 얻었다. 수벌 번데기 추출물에 대한 분획물 중 ethyl acetate 분획물 수율이 3.56%로 가장 낮았고 물 분획물이 39.63%로 가장 높은 수율을 보였다. 대식세포는 여러 조직에 존재하는 면역세포로서 이물질 침입이나 상처 발생 시 가장 먼저 인식하여 급성 염증반응을 개시하는 역할을 한다(Willeaume et al., 1996). 본 연구에서는 RAW264.7 세포에서 수벌 번데기 추출물 및 용매분획물의 세포독성을 확인하기 위해 EZ-Cytox cell viability assay kit를 이용하였다(Fig. 1). 실험 결과 대조군 대비 hexane 분획물에서 90%의 세포생존율을 보여 유의적인 차이를 나타내었고 나머지 시료는 세포독성이 나타나지 않았다. NO는 정상적인 농도로 존재하면 대식세포의 항균 활성, 세포의 신호전달 및 감염성 병원체에 대한 억제 등 다양한 기능을 가지고 있다(Hyun et al., 2015). 반면 생체 내 과발현된 NO는 독성 radical로 작용하여 조직 손상뿐만 아니라 뇌막염, 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 퇴행성 질환에 중요한 요인으로 작용한다고 알려져 있다(Kawamata et al., 2000; Chung et al., 2001). 우리는 LPS로 유도된 RAW264.7 세포에서 수벌 번데기 추출물 및 용매분획물의 NO 생성 저해 활성을 알아보고자 하였다(Fig. 2). 그 결과 LPS 무처리군에 비해 LPS 처리군에서 NO 생성량이 크게 증가하였지만 50 μg/mL 농도의 시료 처리군에서는 butanol 처리군을 제외하고 LPS 처리군과 비교하여 NO 생성량을 유의적으로 억제하였다(methanol 처리군: 13.20%, hexane 처리군: 17.30%, ethyl acetate 처리군: Cell viability (% of control)Compound (50 μg/mL) 0 1 2 3 416.19%, butanol 처리군: 1.61% 억제). 가장 효능이 좋았던 ethyl acetate 추출물에 대한 세포독성 및 NO 생성량 측정을 다양한 농도별로 수행하였다. 그 결과 5 mg/mL까지는 세포 생존에 영향을 주지 않는 것으로 확인되었으나 10 mg/mL에서는 세포 독성(생존율 88.2%)을 유발하였다(Fig. 3). 또한 NO 생성량 억제 효율은 ethyl acetate 추출물 처리량이 높을수록 효과적이였으나 1 mg/mL 이상의 농도에서는 농도 의존성이 높지 않은 것으로 확인되었다Fig. 4).

Fig. 1. 
Effects of compounds on cell viability in RAW264.7 cells. Cell viability was measured using an EZ-Cytox cell viability assay kit. Data are presented as the mean±SD (n=3). *p<0.05 vs. control cells. 1: Methanol extract, 2: Hexane fraction, 3: Ethyl acetate fraction 4: Butanol fraction.

Fig. 2. 
Effects of compounds on NO production in LPS-induced RAW264.7 cells. RAW264.7 cells were pre-treated with compounds (50 μg/mL) for 2 h and then co-treated with LPS (1 μg/mL) for 18 h. Data are presented as the mean±SD (n=3). ^#p<0.05 vs. control cells, *p<0.05 vs. LPS-treated cells. 1: Methanol extract, 2: Hexane fraction, 3: Ethyl acetate fraction 4: Butanol fraction.

Fig. 3. 
Effects of ethyl acetate fractions on cell viability in RAW264.7 cells. Cell viability was measured using an EZ-Cytox cell viability assay kit. Data are presented as the mean±SD (n=3). *p<0.05 vs. control cells.

Fig. 4. 
Effects of ethyl acetate (EA) fractions on NO production in LPS-induced RAW264.7 cells. RAW264.7 cells were pre-treated with various concentration of EA fractions for 2 h and then co-treated with LPS (1 μg/mL) for 18 h. Data are presented as the mean±SD (n=3). ^#p<0.05 vs. control cells, *p<0.05 vs. only LPS-treated cells.

Lee and Kim (2019) 연구에 따르면 LPS 유도된 RAW264.7 세포에서 식용곤충인 쌍별귀뚜라미를 3 mg/mL을 처리하였을 때 높은 NO 저해 활성을 보였지만, 본 실험 결과는 더 낮은 농도인 1 mg/mL에서 유사한 활성을 나타내었다. 또한, Yoon et al. (2014)에 의하면 벼메뚜기 에탄올 추출물에서 항염증 효능을 갖는다고 보고되었다.종합하면 수벌 번데기의 ethyl acetate 분획물에서 세포독성이 적고 NO 생성 억제 활성이 높았고 나아가 세부적인 분리 연구를 통해 주요성분을 밝히고 분자적 수준에서 추가 연구가 필요하다고 판단된다.

본 연구에서는 LPS에 의해 염증을 유도한 RAW264.7 세포에서 수벌 번데기의 추출물 및 용매분획물의 NO 생성 억제 활성을 확인하고자 하였다. 세포생존율 측정 결과 hexane 처리군에서 세포독성을 유발하였으나, 나머지 시료에서는 세포독성을 나타내지 않았다. NO 생성 억제능 결과 butanol 처리군을 제외한 시료에서 유의한 수준으로 NO 생성을 감소시켰다. 이상과 같은 연구 결과를 통해 수벌 번데기의 ethyl acetate 분획물이 항염증 활성 소재로서의 가능성을 가지는 것으로 사료된다.