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분석에 사용된 꿀벌 유충, 번데기, 성충은 2016년 여름 덴마크 Københans Universitet의 양봉장에서 제공한 꿀벌 (Apis mellifera burkfast) 수벌의 유충, 번데기, 성충이며, 유충 및 번데기의 경우 별도 처리없이 동결건조 (Freeze dryer, FD5508, Ilshin Lab Co. Ltd, Korea)하였으며, 성충은 날개를 제거한 후 -50℃에서 72시간 동결건조하여 분말로 조제하였다, 동결건조 분말은 안동대학교 식품영양학과에서 보관하고 있다 (voucher specimen 2018­AP1~3). 기타 시약은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)의 시약급 이상의 제품을 구입하여 사용하였다.

꿀벌 유충, 번데기 및 성충 분말의 pH 및 brix는 5% 용액을 37℃에서 30분간 용출한 후 상등액을 이용하여 측정하였으며, pH 측정은 320 pH meter (Mettler Toledo InLabR 413, UK)로, brix 측정은 refractometer (Atago N­1E, Japan)을 이용하였다. 동결건조 분말의 색차는 색차계 (Super color SP­80 Colormeter, Tokyo Denshoku Co., Japan)를 이용하여 명도 (lightness, L), 적색도 (redness, a), 황색도 (yellowness, b)를 측정하였다. 표준 백색판은 L값 92.39, a값 -0.08, b값 1.39이었으며, 시료당 3회 측정하여 평균값을 구하여 나타내었고 색차 (△E)는 다음의 식을 이용하여 계산하였다 (정과 손, 2014).

꿀벌 유충, 번데기, 성충 동결건조 분말의 에탄올 추출물을 조제하기 위해, 분말 중량에 대해 10배의 95% ethanol (Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. Korea)을 가한 후 상온에서 3회 추출하였다. 이후, 추출액을 filter paper (Whatsman No. 2)로 거른 후 감압 농축 (Eyela Rotary evaporator N­1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd. Japan)한 후 동결건조 (Freeze dryer, FD5508, Ilshin Lab Co. Ltd, Korea)하여 분말로 조제하였다 (Ghosh et al., 2016). 추출 시료들은 DMSO에 적당한 농도로 녹여 활성 평가에 사용하였다.

꿀벌 유충, 번데기, 성충 추출물의 항당뇨 활성은 α-amylase, β-amylase 및 α-glucosidase 저해 활성을 평가하여 나타내었다. 먼저 α-amylase 저해활성은 KI/I₂ 발색법 (Lim et al., 2005)을 이용하여 평가하였으며, 추출물 시료 2.5 μL와 50 mM phosphate buffer (pH 6.8)로 희석한 α-amylase (0.25 U/mL) 25 μL를 혼합하여 37℃에서 10분간 preincubation한 후, 0.5% soluble starch (Samchun Chemicals Co., Korea) 25 μL를 가하여 37℃에서 10분간 반응하였다. 이후 2N acetic acid를 25 μL 가하여 반응을 정지시켰으며, 반응액에 0.75% KI/I₂ 용액 10 μL를 가하여 발색하였다. 발색액은 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 각각의 실험은 3반복한 후 평균값을 구하여 다음의 식으로 저해율을 계산하였다.

꿀벌 유충, 번데기, 성충 추출물의 β-amylase 활성은 시료 2.5 μL와 50 mM phosphate buffer (pH 6.8)로 희석한 β-amylase (0.25 U/mL) 25 μL를 각각 혼합하여 37℃에서 10분간 preincubation한 후, 0.5% soluble starch (Samchun Chemicals Co., Korea) 25 μL를 가하여 37℃에서 10분간 반응하였다. 이후 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시켰으며, 반응액에 150 μL의 3,5­dinitrosalicylic acid 용액을 첨가하여 100℃에서 5분간 가열, 발색한 후 상온에서 방냉하였다. 발색액은 96 well microplate reader (Tecan Co., USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 각각의 실험은 3회 반복한 후 평균값을 구하여 아래의 식으로 저해율을 계산하였다 (성 등, 2019). 한편 α-glucosidase 저해활성은 p-nitrophenol glucoside (Sigma Co., USA)를 이용하여 평가하였으며, 추출물 시료 2.5 μL와 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.6)로 희석한 α-glucosidase (0.25 U/mL) 25 μL를 혼합하여 37℃에서 10분간 반응하고 1 mM p-nitrophenol glucoside 용액 25 μL를 가하여 60℃에서 10분간 반응하였다. 이후 1 M NaOH 25 μL를 첨가하여 반응을 정지시키고, 405 nm에서 흡광도를 측정하여 저해율을 계산하였다 (성 등, 2019).

꿀벌 유충, 번데기, 성충 추출물이 혈액응고에 미치는 영향은 thrombin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT)을 각각 측정하여 평가하였다 (Eikelboom et al., 2010). TT는 37℃에서 thrombin (0.5 U, Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 50 μL와 CaCl₂ (20 mM) 50 μL, 다양한 농도의 시료 10 μL를 Amelung coagulometer (Amelung, Lemgo, Germany) 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100 μL를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. PT 측정은 혈장 70 μL와 다양한 농도의 시료 10 μL를 coagulometer 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130 μL의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 내인성 혈전 생성의 지표인 aPTT는, 표준혈장 70 μL와 다양한 농도의 시료 10 μL를 coagulometer 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 65 μL의 aPTT reagent를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 반응하였다. 이후 65 μL CaCl₂ (35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다 (김 등, 2016). 모든 실험은 3회 반복하여 평균치로 나타내었으며, 각각의 항응고 활성은 시료 첨가시의 응고 시간의 평균치를 무첨가시의 응고시간의 평균치의 비로 나타내었다 (Kim et al., 2016).

꿀벌 유충, 번데기, 성충 추출물이 혈소판 응집에 미치는 영향은 Whole Blood Aggregometer (Chrono­log, PA, U.S.A)를 사용하여 impedance 법으로 평가하였다 (Sweeney et al., 1990). 먼저 인간 농축 혈소판 (platelet rich plasma: PRP)을 전처리 및 수세한 후 최종 혈소판 농도가 5×10⁸/mL이 되도록 조정하여 사용하였으며, 응집유도제로 collagen (1 mg/mL)을 사용하였다. 혈소판 응집반응은 collagen 첨가 후 12분간 측정하였으며 amplitude, slope, area under를 측정하여 평가하였다. 이때, amplitude는 혈소판에 응집유도제를 첨가하였을 때 일어나는 최대 응집정도를 나타내며, slope는 응집유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 나타내며, area under는 전체적인 혈소판 응집 정도를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 slope 곡선의 하강면적을 의미한다 (Babic et al., 2019). 혈소판 응집 저해 활성은 시료 첨가시의 area under값과 DMSO를 첨가한 대조구의 area under값의 비로 나타내었다.

각각의 분석 결과는 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 나타내었다. 실험 결과는 SPSS 25.0 버전을 사용하여 mean±SD로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며, 유의수준은 p<0.05로 하였다.

조제된 꿀벌 유충, 번데기, 성충 분말의 성상과 이화학적 특성은 Fig. 1 및 Table 1에 나타내었다. 먼저 5% 용액의 pH는 유충, 번데기, 성충에서 각각 5.6, 5.2 및 5.0을 나타내어 성장, 우화에 따라 산성화되었으며, brix의 경우에는 3종 시료에서 1.1~1.2를 나타내어 유사하였다. 또한 꿀벌 유충 및 번데기는 옅은 황색의 미세분말인 반면, 성충의 경우 어두운 황적색 분말로 얻어졌다. 색차 분석 결과 유충 및 번데기 분말은 매우 유사한 명도 (75.12~75.40), 적색도 (-0.50~-0.58), 황색도 (16.23~16.54)를 나타내어 육안으로 구분하기 어려운 미미한 색차 (22.74~22.77)를 나타내었다. 반면 성충 분말은 명도 48.94, 적색도 2.26, 황색도 9.63을 나타내어 최종 색차는 44.25를 나타내었다.

Fig. 1. 
Photography of the freeze-dried powders of larvae, pupae and adult of honeybee drone.

꿀벌 유충, 번데기, 성충 분말의 에탄올 추출 효율은 각각 21.82±0.5, 22.25±0.3 및 14.16±0.1%로 나타나 유충과 번데기는 유사한 추출효율을 보인 반면, 성충의 경우 번데기에 비해 약 64%의 추출효율을 나타내었다. 꿀벌 유충, 번데기, 성충의 조지방 함량이 각각 14.5%, 16.0% 및 6.9%임 (Ghosh et al., 2016)을 고려한다면, 추출물들은 지용성 물질을 다량 포함하고 있음을 알 수 있었다.

꿀벌 유충, 번데기, 성충 추출물의 항당뇨 활성은 α-amylase, β-amylase 및 α-glucosidase 저해활성을 평가하여 나타내었다 (Table 2). 먼저 임상에서 항당뇨제로 사용되고 있는 acarbose는 농도 의존적인 전분 분해효소 저해를 나타내었으며, 특히 0.5 mg/mL 농도에서 각각 35.2%, 49.8% 및 79.2%의 강력한 저해를 나타내었다. 꿀벌 유충, 번데기, 성충 추출물은 0.5 mg/mL 농도에서 α-amylase에 대해 17.4~17.8%, α-glucosidase에 대해 5.8~9.2% 저해를 나타내어 양호한 항당뇨 활성을 나타내었다. 반면 β-amylase 저해활성은 유충, 번데기, 성충 추출물 모두에서 인정되지 않았다.

현재까지 꿀벌 추출물의 항혈전 활성은 이미 생성된 혈전을 분해하여 혈행을 개선하는 fibrin 분해활성 (김 등, 2013; Choi et al., 2018)에 한정되어 있으며, 혈전 생성 및 혈액 응고와 관련된 트롬빈, 프로트롬빈, 혈액응고인자들에 미치는 영향은 알려진 바 없다. 따라서 꿀벌 유충, 번데기, 성충 추출물의 혈액응고에 미치는 영향을 TT, PT, aPTT를 측정하여 평가하였다. 먼저 활성 대조구인 aspirin은 1.5 mg/mL 처리시 용매 대조구에 비해 TT, PT, aPTT를 각각 1.43, 1.73 및 1.42배 증가시켜 우수한 항응고 활성을 나타내었다 (Fig. 2). 반면 꿀벌 유충, 번데기, 성충 추출물은 모두 5 mg/mL 농도까지 TT, PT, aPTT의 변화가 나타나지 않았다. 이러한 결과는, 꿀벌 독의 혈액응고 저해활성 (Zolfagharian et al., 2015)은 알려져 있으나, 꿀벌 유충, 번데기 및 성충 추출물들은 fibrin 분해활성은 나타내나 (김 등, 2013; Choi et al., 2018), fibrin 혈전 생성에 관여하는 프로트롬빈, 다양한 혈액응고인자 및 트롬빈 활성에는 영향을 미치지 않음을 의미하고 있다.

Fig. 2. 
Effect of the ethanol extracts of larvae, pupae and adult of honeybee drone on blood coagulation. A: thrombin time, B: prothrombin time, C: activated partial thromboplastin time. Different superscripts (a, ab and b) within a panel differ significantly (p<0.05).

혈소판은 다양한 혈구세포와 함께 혈관을 순환하는 원반형의 작은 세포로서, 핵이 없는 대신 혈관 손상보호 및 혈소판 응집과 관련된 다양한 물질을 고농도로 포함하는 cytoplasmic granule을 가지고 있으며, 혈관내벽의 손상이 나타나는 경우 응집인자들을 분비하고, 내피세포의 손상으로 노출된 collagen 등과 결합하여 1차 지혈 플러그 (primary hemostatic plug)를 형성하여 혈전생성을 개시하는 중요한 세포이다. 따라서 혈소판 응집저해 활성을 나타내는 아스피린은 다양한 혈전성 질환의 예방과 치료에 사용되고 있다 (Kim et al., 2016).

현재까지 꿀벌 유충, 번데기, 성충 추출물의 혈소판 응집에 대한 보고는 알려진 바 없으므로, 조제된 추출물을 이용하여, 혈소판 응집에 미치는 영향을 impedance 법으로 측정하였다. 먼저 임상에서 혈소판 응집 저해제로 사용되고 있는 아스피린은 0.25 및 0.5 mg/mL 농도에서 용매 대조구에 비해 각각 54.3% 및 29.5%의 혈소판 응집율을 나타내어 농도 의존적인 강력한 혈소판 응집저해 활성을 나타내었다 (Table 3, Fig. 3b, 3c). 그러나, 성충 추출물의 경우 혈소판 응집에 영향을 미치지 않았으며 (Table 3, Fig. 3f), 유충 및 번데기 추출물의 경우에는 0.25 mg/mL 농도에서 각각 235.7% 및 240.7%의 응집율을 나타내어 강력한 혈소판 응집활성을 보였다 (Table 3, Fig. 3d, 3e). 따라서 벌꿀 수벌의 유충 및 번데기 추출물은 혈소판 응집에 의한 혈전 생성을 촉진하여 지혈작용을 나타낼 수 있음을 확인하였으며, 성충 추출물은 혈액 응고 및 혈소판 응집 촉진 활성이 없어 혈전 생성과 무관함을 확인하였다. 또한 모링가의 지하부 (권 등, 2019) 및 우엉 뿌리 (김 등, 2014)에서와 같이 추출물 자체로는 강력한 혈소판 응집을 통한 지혈작용을 나타내나, 활성 분획물의 경우 오히려 강력한 항혈전 활성을 나타내는 경우도 있으며, 당귀 및 오미자 (김 등, 2017)와 같이 추출 용매별, 추출 부위별 혈소판 응집활성의 차이가 크게 나타나는 경우가 알려진 바, 벌꿀 수벌 유충 및 번데기 추출물의 혈소판 응집촉진 활성은 응집촉진활성 물질의 분리 및 특성 규명이 필요하다고 판단된다. 본 연구 결과는 국내에서 식품원재료로 등록되지는 않았으나, 미래 식품소재로 연구가 집중되고 있는 수벌 유충, 번데기, 성충 추출물이 항당뇨 소재로 개발 가능하며, 유충 및 번데기 추출물은 지혈제로 이용 가능함을 제시하고 있다. 향후 유충 및 번데기 추출물의 혈소판 응집 촉진 기작에 대한 연구가 필요하며, 이는 수벌 식용화의 기초 자료로 활용될 것이다.

Fig. 3. 
Impedance changes during collagen-induced platelet aggregation after addition of aspirin and the ethanol extract of larvae, pupae and adult of honeybee drone in whole blood aggregometer. Symbols: (A) DMSO, (B) aspirin (0.25 mg/mL), (C) aspirin (0.5 mg/mL), (D) larvae extract (0.25 mg/mL), (E) pupae extract (0.25 mg/mL) and (F) adult extract (0.5 mg/mL).