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전남 광양에서 재배하여 2019년 6월 말에 수확한 남고 (南高, Nanko) 홍매실을 농가에서 구입하였다. 아카시아꿀, 밤꿀, 잡화꿀은 2019년도에 한국양봉농업협동조합 (Anseong, Korea)에서 ‘벌꿀의 규격 기준’ (식품의약품안전처, 2019)에 만족하는 제품을 구입하여 실험에 사용하였다.

남고 홍매실을 수확한 다음 날, 베이킹 파우더로 수세한 후 씨를 제거하고 4등분하여 살균 소독한 사각 유리 용기에 4등분한 매실을 먼저 넣은 다음 백설탕, 아카시아꿀, 밤꿀, 잡화꿀을 매실과 1 (2.1 kg) : 1 (2.1 kg)의 무게비로 각각 첨가하였으며, 100일 동안 상온에서 밀봉상태로 차광하여 보관하였고, 일주일 간격으로 용기를 흔들어 주었다. 저장 100일 후, 각 시료 유리 용기에 포함된 매실 및 부유물은 거름망을 이용하여 제거한 다음 액상 상태의 매실청을 분석 시료로 사용하였다.

건강기능식품공전 (2019) 구연산 시험법에 따라 구연산 함량 분석을 실시하였다. 시료 1 g에 증류수 50 g을 가하여 희석한 후 아세토니트릴/증류수 (1 : 1)로 활성화시킨 C18 카트리지에 희석된 시료 10 mL을 가하여 초기 용출액 4 mL을 제거한 다음 6 mL을 분취하였다. 용출액은 0.45 μm syringe filter로 여과한 후 분석에 사용하였다. 구연산의 HPLC 분석 조건은 Table 1과 같다.

건강기능식품공전 (2019)에 제시된 무기질 건식분해법에 따라 무기질을 분석하였다. 시료를 550~600℃에서 완전히 회화한 후 남은 회분에 물을 적시고 염산을 가하여 완전히 증발 건고한 다음 건고물에 염산을 가하여 100 mL 부피 플라스크에 여과하고 증류수로 정량하여 분석 시료로 사용하였다. 무기질 Ca, K, Mg 분석은 유도결합플라즈마 분광분석기 (Inductively coupled plasma optical emission spectrometer, ICP-OES)를 사용하였고 분석조건은 Table 2에 나타내었다.

건강기능식품공전 (2019)에 제시된 Folin-Denis 방법에 따라 매실청의 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. 즉, 시료를 50 mL 부피 플라스크에 취한 후 메탄올을 넣고 초음파로 추출한 다음 시험관에 추출액과 증류수 7.5 mL, Folin-Denis 시약 (Sigma Aldrich, St. Loius, MO, USA) 0.5 mL, 35% 탄산나트륨 1 mL을 넣고 혼합하여 상온에 30분간 방치한 후 760 nm에서 흡광도 (Spectramax M2^e, Molecular devices, San Jose, CA, USA)를 측정하였다. 매실청 내 총 폴리페놀 함량은 표준물질 탄닌산으로 표준 곡선을 작성한 다음 정량하였다.

항산화 활성은 Blois (1958)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 각 농도별로 제조한 시료 20 μL에 200 μM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma Aldrich, St. Loius, MO, USA) 180 μL를 넣고 30분간 실온에 방치한 다음 분광광도계를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

구연산 함량, 무기질 함량, 총 폴리페놀 함량, 항산화 활성 평가는 본 실험에서 제조한 매실청 각 시료를 3회 측정하여 평균값±표준편차 (mean±standard deviation)로 나타냈으며 SPSS Statistics 18 (IBM Co., Armonk, NY, USA)프로그램을 이용하여 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA) 후 Duncan’s multiple test를 이용하여 유의성 95% (p<0.05) 수준에서 검증하였다.

구연산은 체내 생성된 젖산을 체외로 배출시켜 피로 개선 효과 (Tomohiro et al., 2007)를 가지는 물질로 건강기능식품 기능성 원료인 매실 추출물의 지표 성분이다 (식품의약품안전처, 2019). 본 연구에서는 설탕, 아카시아꿀, 밤꿀, 잡화꿀로 제조한 매실청에 포함된 구연산의 함량을 측정하여 그 결과를 Table 3에 나타내었다. 벌꿀로 제조한 매실청의 구연산 함량은 밤꿀로 제조한 매실청에서 16.9 mg/g로 가장 높게 측정 되었으며 아카시아꿀 및 잡화꿀로 제조한 매실청은 설탕으로 제조한 매실청 (16.7 mg/g)보다 낮은 함유량을 나타내었다. 매실청의 구연산은 고농도의 당에 의한 삼투압 작용으로 매실 과육으로부터 구연산이 용출되는데 당의 농도 및 산도가 매실청 내 구연산의 확산속도에 영향을 끼치는 것으로 알려져 있다 (차 등, 1999; 배와 유, 2019). 김 등 (1991)은 벌꿀의 생산지, 숙성기간, 밀원에 따라 산도 (pH 3.5~4.7) 및 구연산 함량 (0.8~61.0 mg%)이 다르게 나타나며, 김 등 (2017)은 시중에 유통되는 아카시아꿀, 밤꿀, 잡화꿀의 과당, 포도당 및 설탕의 총 함량이 64.89~72.79%로, 밀원별로 차이를 나타내는 것으로 보고하였다. 본 연구에서 제조한 매실청 4종의 구연산 함량 차이는 각 시료의 당 함량, pH 등이 관여하여 매실 과육으로부터 구연산 용출에 영향을 미쳤을 것이라 판단된다.

무기질은 체내 합성이 되지 않는 물질로 인체를 구성하고 체내 수분조절, 면역 조절, 세포의 성장, 혈압 유지 등 다양한 생리 작용에 관여하고 부족하게 되면 질병을 야기할 수도 있어 식품 등을 통하여 섭취해야 하는 영양소이다 (Blumfeld et al., 2013). 매실에는 칼슘 (Ca), 인 (P), 철 (Fe), 칼륨 (K), 아연 (Zn), 구리 (Cu), 나트륨 (Na), 마그네슘 (Mg) 등이 존재하는 것으로 알려져 있으며 칼륨, 칼슘, 마그네슘이 주요 무기질이다. 벌꿀로 제조한 매실청의 주요 무기질 함량을 살펴보면 (Table 4), 밤꿀로 제조한 매실청에 함유된 칼륨, 칼슘, 마그네슘은 각각 205.5, 9.8, 7.3 mg/100 g로 아카시아꿀, 잡화꿀 및 설탕으로 제조한 매실청보다 높은 함량을 나타냈으며, 체내 나트륨 배출 및 혈압유지 (Weaver, 2013)에 관여하는 칼륨은 각 시료의 주요 무기물 중 가장 높은 함량으로 측정되었다. 이는 강 등 (1999)이 보고한 매실 과육과 매실 착즙박의 무기질 분석 결과와 일치하였다. 특히, 밤꿀로 제조한 매실청의 칼륨은 3종의 매실청보다 더 높은 함유량을 나타냈는데, 이는 밤꿀로 제조한 매실청의 저장기간 동안 매실 과육으로부터 용출되는 칼륨과 밤꿀에 함유된 칼륨이 합쳐진 결과라 생각한다. 밤꿀에는 아카시아꿀의 8배, 잡화꿀의 3배 정도 많은 칼륨을 함유한다고 알려져 있다 (정 등, 2011).

폴리페놀 (polyphenol)은 과일, 채소 등 식물에 존재하는 2차 대사산물로 탄닌 (tannin), 플라보노이드 (favonoid) 등 다양한 화학적 구조를 가지고 있으며 항염, 항암 등의 약리 효과를 나타내고 천연항산화제로 알려진 피토케미컬 (phytochemical)이다 (Can et al., 2015). 폴리페놀은 다양한 생리활성을 지니고 있으며 특히 항산화 활성에 대한 기준물질로 알려져 있다. 벌꿀로 제조한 매실청의 총 폴리페놀 함량은 벌꿀 종류별로 차이를 보였으며 밤꿀로 제조한 매실청에서 0.71 mg/g로 가장 높게 측정되었다 (Table 5). 이는 매실청이 숙성됨에 따라 매실에서 용출되는 폴리페놀과 밤꿀에 존재하는 폴리페놀이 합쳐진 결과라 판단된다. 최 등 (2009)은 밤꿀에는 폴리페놀이 0.67 mg/mL로 아카시아꿀보다 10배 이상 높다고 보고하였다.

본 연구에서는 벌꿀로 제조한 매실청의 항산화 활성을 확인고자 DPPH 유리기 (free radical)를 이용하여 소거능 (scavenging activity)을 측정하였다. 그 결과, 설탕으로 제조한 매실청은 벌꿀 시료 3종보다 낮은 DPPH 소거능을 보였으며 밤꿀로 제조한 매실청은 5000 μg/mL에서 31.5%의 가장 높은 DPPH 소거능을 나타내었다 (Table 6). 이러한 결과는 밤꿀로 제조한 매실청에 다른 시료 3종보다 항산화제로 알려진 폴리페놀 함량이 높아 항산화 활성이 높게 나타난 것으로 판단된다. 반면, 아카시아꿀 및 잡화꿀로 제조한 매실청은 설탕으로 제조한 매실청보다 항산화 활성이 높게 측정되었다. 이는 벌꿀에 포함된 항산화 활성 성분인 (김 등, 2017; Jabeen et al., 2018; Kim et al., 2020) 비타민 B 계열 나이아신 (niacin), 황 함유 아미노산 시스테인 (cysterin) 등이 DPPH 유리기 소거에 관여한 것으로 판단된다.