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실험에 사용한 매실은 2013년 생산된 남고 품종을전남 광양군 생산지에서 직접 구입하였다(개화 후 90 일경). 아카시아꿀은 2012년에 생산된 벌꿀로 한국양봉협동조합으로부터 구입하여 사용하였다.

매실은 흐르는 물에 까끗이 세척한 다음 완전히 자연건조 시킨 후, 매실과 아카시아꿀을 1:1.5의 중량% 비로 50g의 매실, 750g의 아카시아꿀을 교대로 혼합하여 2개월 동안 통풍이 잘되는 그늘에서 숙성시켜 추출하였다(Fig. 1). 아카시아꿀 매실추출물은 whatman 여과지(No. 3)를 사용하여 여과하고, 여과된 여액과 동결건조 후 시험에 사용하였다.

Fig. 1. 
Content of citric acid in honey maesil (Prunus mume) extracts by HPLC. A: Citirc acid standard, B: honey maesil.

벌꿀 매실추출물 중의 구연산 함량 분석은 건강기능식품공전 시험법(식품의약품안전처, 2014)에 따라 수행하였다. 표준물질 구연산(Citric acid, Sigma, USA은 2mg/mL의 농도로 녹여 표준용액으로 하였고, 벌꿀 매실추출물 시료는 1g/ml의 농도로 증류수로 희석하고 sep-Pak C18 커트리지(sep-Pak C18 Cartridges, Waters, USA)를 이용하여 불순물을 제거 한 후 0.45μm 맴브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용하였다. 구연산 함량 분석은 고속액체크로마토그래프(HPLC, Agilent infinity 1290, USA)를 Halo^TM C18 컬럼을 사용하여 Table 1과 같은 조건으로 분석한 후 아래와 같은 계산식을 사용하였다.

구연산 함량(mg/g)=C×(a×b)/S

C: 시험용액 중의 구연산 농도(mg/mL)
a: 시험용액의 전량(mL)
b: 희석배수
S: 시료 채취량(g)

벌꿀 매실추출물 중의 시안화물의 검출여부는 건강기능식품공전 시험법(식품의약품안전처, 2012)에 따라 수행하였다. 벌꿀 매실추출물 20g을 200mL 삼각플라스크에 취한 후 구연산 완충액(구연산 128.1g, 수산화나트륨 64.4g을 증류수에 용해시켜 1L로 하고 pH 5.9로 조절) 50mL를 가한다. 삼각플라스크를 피크린 산지를 매달은 코르크마개로 밀전하고 실온에서 3시간 동안 방치한다. 이후 주석산을 2g 가하고, 신속하게 코르크마개를 밀전하고, 혼합하면서 50∼60°C에서 1시간 방치한 후 피크린산지의 색변화를 관찰하여 시안화합물의 검출여부를 판별한다.

식품공전의 일반시험법 미생물시험법 대장균 시험법에 따라 건조필림법을 사용하여 벌꿀 매실추출물의 대장균 검출 여부를 분석하였다(식품공전, 2014).

벌꿀 매실추출물의 전화당 및 자당의 함량은 식품공전의 일반시험법 액체크로마토그래프 시험법에 따라 수행하였다(식품의약품안전처, 2014). 컬럼은 카보하이드레이트, 검출기는 시차굴절계(RI)를 이용하였다. 표준당 용액은 포도당 및 과당 각 1g, 자당 0.1g을 증류수 100mL에 녹여 준비하였고, 이동상은 아세토니트릴과 물(아세토니트릴:물=75:25(v/v))을 사용하여 분석하였다. 얻어진 피크의 높이와 면적으로 아래 식에 따라 벌꿀 매실추출물의 전화당 및 자당의 함량을 산출하였다.

당(%)=PHPH′×VV1×W1W×100

pH, pH': 검액과 표준액의 높이 또는 면적
V, V¹: 검액과 표준액의 정량(mL)
W, W¹: 검체 및 표준당의 채취량(g)

매실을 열수로 추출한 후 여과·농축한 매실추출물은 피로 개선에 효능이 있는 고시형기능성식품으로 등재되어 있다(식품의약품안전처, 2014). 건강기능성식품으로 인정되는 매실추출물의 지표성분은 구연산이며, 함량은 300∼400mg/g으로 설정되어 있다. 본 연구에서는 예로부터 민간과 한방에서 피로회복, 종기, 동상, 빈혈증 등 다양한 약리효과로 약제로 사용되어 왔으며(Rossiter et al., 2010), 설탕 대용 천연 감미료로 이용되는 벌꿀을 이용하여 매실추출물을 제조했을 경우 벌꿀 매실추출물이 기능성식품원료로 사용 가능성을 알아보고자 하였다. 벌꿀은 포도당과 과당을 주성분으로 하는 단당류이기 때문에 체내장벽에서 직접 흡수되어 영양제로서 가치가 크다(Erejuwa et al., 2012). 벌꿀은 주로 유럽 및 미국, 호주, 뉴질랜드 지역에서는 식료나 식품의 감미료로 주로 소비되고 있다. 그러나 아직까지 우리나라에서는 감미료로서의 벌꿀 소비는 설탕에 비하여 적은 편이며, 벌꿀을 이용한 다양한 용도 개발이 미흡한 실정이다. 식품공전 벌꿀 규격인 수분 21% 이하의 아카시아꿀을 이용하여 설탕 대용으로 매실추출물을 제조하여 2개월 동안 냉장 보관한 후 구연산 함량을 분석하였다. 그 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 평균 10.2mg/g의 구연산이 함유되어 있었다. 따라서 벌꿀을 이용하여 매실을 추출하더라도 구연산이 건강기능성식품 기준규격에 적합 하다라는 것이 확인되었으며, 열수추출하여 농축한 추출물을 건강기능성식품으로 사용하는 것과 같이 벌꿀 매실추출물도 농축한다면 충분히 건강기능성식품 원료 규격에 적합한 것으로 사료되었다.

시안화수소는 화학식이 HCN인 화합물로 시안화 수소의 수용액을 시안화수소산 혹은 청산이라 부른다. 시안화수소의 염은 시안화합물이라고 한다. 시안화수소는 차의 배기가스, 담배 및 나무의 연기, 질소함유 플라스틱을 태울 때 나는 연기에 포함되어 있고 시안화물은 화재 시 질병과 사망의 원인이 되는데 매화나무속과 같은 종식물의 종자 속에 글리고시도아미다린으로 존재한다고 알려져 있다(권 등, 2006; 김등, 2010). 공기 중에 300ppm의 시안화수소가 있으면 몇분 안에 사람이 죽을 수 있는데 이러한 독성은 시안화합물 이온에 의해 일어난다(도 등, 2007). 시안화수소는 화학전에 사용되는 약품목록에 흔히 포함되는데 이런 것들은 전신 중독을 일으킨다고 알려져 있다(도 등, 2007). 따라서 식용하는 매실추출물에서는 시안화합물이 검출되어서는 안 된다(김 등, 2010; 식품의약품안전처, 2014). 벌꿀을 이용한 매실추출물에서는 Fig. 2에서 보는 바와 같이 시안화합물이 전혀 검출되지 않아 식용으로 충분히 안전하였다.

Fig. 2. 
Results of honey maesil (Prunus mume) extracts in picrate method. The color of picrate paper is not changed. This result showed that honey maesil extracts have not include the cyan compound. 1: honey maesil extracts treatment before picrate paper, 2: honey maesil extracts treatment after picrate paper.

벌꿀을 이용한 매실추출물에서는 식품 및 기능성 식품원료 기준인 대장균 검출 반응에서 음성으로 확인되었다(식품의약품안전처, 2014, Fig. 3). 따라서 벌꿀 매실추출물은 대장균 검출에 있어 안전한 것으로 사료되었다

Fig. 3. 
Detection of Escherichia coli. in honey maesil (Prunus mume) extracts. The color of detection paper of Escherichia coli. is not changed. This result showed that honey maesil extracts have not include Escherichia coli. left: honey maesil extracts not treatment, right: honey maesil extracts treatment.

벌꿀의 감미는 과당, 포도당 등의 당류 때문이다.벌꿀은 자당에 비하여 흡수 이용이 빠르며, 감미가 1.5∼2배 이상 높아, 영양 및 감미료로 이용되고 있다(Erejuwa et al., 2012). 에너지가 높은 탄수화물 식품으로 쉽게 흡수되어 피로회복에 도움이 되어 운동선수나 힘든 직업인을 위해 좋은 식품이다. 또한 의학적으로 미생물 억제 효과, 간기능 촉진과 해독효과, 높은 삼투압과 아세칠콜린등의 물질이 소장의 연동운동을 촉진시켜 배설작용 도움이 되며, 빠른 에너지 공급, 미백 및 피부 보습 효과 등이 있어 이용되고 있다. 매실추출물의 기능성분은 구연산이 300∼400mg/g 함유되어 있어야 하며, 시안화합물과 대장균군은 검출되지 말아야한다고 규정되어있다. 고시형건강기능성식품원료로의 매실추출물의 기능은 피로개선이다. 매실을 열수로 추출한 후 여과·농축하는 방법 또는 설탕을 사용하여 추출하는 방법으로 매실추출물을 얻고 있다. 그러나 본 연구에서는 설탕 대용 높은 삼투압 및 감미효과 뿐만 아니라 전화당 비율이 높아 체내 흡수가 용이하고 벌꿀의 다양한 기능성이 첨가된 벌꿀 매실추출물을 조제하였다. 65%의 이상의 전화당, 7% 이하의 자당 함량이 벌꿀 규격이다. 벌꿀 매실추출물은 Table 2의 결과와 같이 2개월 후 전화당의 함량은 43.48%, 자당은 1.9%인 반면 설탕을 이용한 매실추출물에선 전화당 함량이 8.7%, 자당은 39.9% 였다. 하 등의 (2005)의 연구에서는 에탄올 매실추출물에서는 전화당 함량은 2.4%, 자당은 0.5%로 보고되어있다. 일반적으로 자당은 비만 등 성인병을 비롯하여 면역력 저하, 체내 칼슘 부족을 야기하는 것으로 알려져 있다(Erejuwa et al., 2012). 따라서 벌꿀을 이용하여 매실추출물을 제조할 경우 벌꿀이 갖고 있는 피로회복 효과, 빠른 체내 흡수 등의 다양한 기능이 보강되어, 피로개선에 좀 더 효율적일 것으로 사료된다.