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본 실험에 사용한 로얄제리는 경기도 안성, 강원도 철원, 경상남도 진주에서 꿀벌(Apis mellifera)로부터 2013년 6월에서 7월사이에 채집한 것을 구입하여 사용하였으며, acetonitrile, methanol, water는 Burdik & Jackson(Muskegon, Ml, USA)사의 HPLC등급으로 사용하였다. 지표성분으로 사용된 10-HDA는 Nacalai tesque(Kyoto, Japan)사에서 구입하였으며, 내부 표준품 hesperidin은 식품의약품안전처(Cheongju, Korea)에서 구입하였다.

로얄제리를 용량플라스크에 넣은 후 메탄올을 사용하여 5mg/mL의 농도가 되도록 만들고 40°C에서 30분간 초음파 추출기를 사용하여 추출한 후 0.2μm 필터를 사용하여 여과하였다. 표준품 10-HDA(1mg/mL)는 메탄올을 이용하여 로얄제리 전처리법과 동일하게 실시하였으며, 이때 내부표준품 heperidin의 농도는 30μg/mL이 되도록 하였다. 시료 및 표준용액은 실험 전까지 4°C 냉장고에 보관하였다.

정량분석에 사용된 기기는 Agilent(Santa clara, CA, USA)사의 auto sampler, column oven, binary pump, diode array detector가 장착된 1290 infinity모델을 이용하였으며 Agilent사의 Zorbax Eclipse Plus C18(2.1×50mm, 1.8μm) 컬럼을 장착하여 유속 1.0mL/min, 주입량 1μL, 컬럼온도 40°C, 검출파장 210nm로 설정하였고, 이동상은 (A) acetonitrile과 (B) 0.1% H₃PO₄ 사용하여 (A) 13∼20% 기울기 조건에서 5분동안 분석하였다.

로얄제리 내 10-HDA에 대한 UHPLC 분석법의 타당성을 검증하기 위하여International Conference on Harmonization (ICH) 가이드라인에 따라 밸리데이션 파라미터인 직선성, 정밀성, 정확성(회수율), 검출한계, 정량한계 등을 평가하였다(International conference of harmonization, 1995; 1997).

지표성분의 각 농도에 대한 유의성 확인과 검량선을 작성하기 위하여 지표성분을 methanol를 사용하여 5가지 농도로 단계 희석하였다. 작성된 검량선으로 부터 산출된 회귀방정식은 y=ax+b (a: 직선식의 기울기, x: 시료의 농도, y: 피크의 면적)의 일차방정식으로 나타냈으며 상관계수(R²)를 확인하여 직선성(linearity)을 평가하였다.

분석물질의 검출한계(limit of detection, LOD)와정량한계(limit of quantification, LOQ)는 검량선에 근거하여 검출한계=3.3×σ/S, 정량한계=10×σ/S (σ: 회귀직선의 y절편 표준편차, S: 검량선의 기울기)의 식에 의해 산출하였다.

분석시간 변동에 따른 분석물질의 함량변화를 알아보기 위하여 직선성이 확인된 3가지 농도에 대해서 intra-day variability를 3회씩 반복하여 측정하였고, inter-day variability는 실험시작일로부터 48시간, 96시간 후에 각 농도에 대하여 3회 반복하여 측정하였다. 분석 결과는 상대표준편차(RSD) 값으로 나타내어 분석물질의 정밀성(precision)을 평가하였다.

직선성의 범위 내에 이미 알고 있는 3가지 농도를 로얄제리 시료에 첨가하여 3회 반복 측정한 후 평가하였으며, 측정된 결과는 표준용액의 양과 비교하여 정확성(accuracy)의 지표인 회수율(recovery)로 나타내었다.

경기도 안성에서 생산된 로얄제리를 표준으로 하여 UHPLC를 이용한 로얄제리 내 10-HDA의 새로운 분석법을 개발하고자 2.7μm RP-amide 및 1.8 um C18컬럼 등과 이동상의 용매 조성비 변화, 컬럼의 온도변화를 주어 분석조건을 검토하였다. 그 결과, acetonitrile과 0.1%H₃PO₄를 이용한 기울기 조건, 컬럼온도 40°C, 1.8 um C18 컬럼을 사용하였을 때, 10-HDA의 머무름 시간은 2.11분이었으며, 1.83분과 2.44분에 검출되는 피크와의 분리도는 4.0정도로 높은 분리능을 가지는 것으로 확인되었다. 또한 로얄제리 내 검출된 지표성분의 피크와 표준용액의 피크 UV 흡수파장이 일치하여 피크의 순도 역시 양호하였다(Fig. 1).

Fig. 1. 
UHPLC chromatograms of raw royal jelly (A, 5mg/mL) and 10-HDA (B, 100μg/mL) at 210nm. IS: internal standard (hesperidin 30μg/mL).

현재 식품공전에 고시된 생로얄제리 및 로얄제리 가공품에 대한 품질평가는 10-HDA를 지표성분으로하여 HPLC 분석이 사용되는데, 이 분석법의 경우 10-HDA의 머무름 시간은 7-10분 사이이며, Kim 등(Kim and Lee, 2010)의 연구에서도 10-HDA의 검출시간은 7분 정도이다. 하지만 본 분석방법은 5분 정도 단축시켜 기존의 방법보다 신속하게 분석할 수 있는 것으로 확인되었다.

10-HDA의 농도를 300, 100, 50, 10, 5μg/mL로 설정하여UPHLC로 분석한 후 검량선을 작성하였다. 작성된 검량선으로부터 산출된 회귀방정식(y=ax+b)은 Y=4.065x+5.152이었으며, correlation coefficient (R2)는 1.000으로 매우 양호한 양의 상관성을 보였다. 직선식의 기울기와 y절편의 표준편차를 이용하여 검출한계와 정량한계를 계산한 결과 각각 0.24μg/mL, 0.74μg/mL이었다(Table 1).

분석환경 및 시간 변동에 따른 변화를 확인하기 위하여 10-HDA의 100, 50, 10μg/mL 농도에서 intra-day와 inter-day 정밀성은 RSD 5% 이내에서 평가되었다. 그 결과, intra-day 시험에서 0.27~0.91%의 RSD값을 나타내었고, inter-day 시험에서는 0.43~2.56%의 RSD값을 보였다(Table 2). 또한 로얄제리 시료를 6회 반복 측정하여 반복성(repeatability) 시험을 한 결과 0.26%의 RSD값으로 우수한 정밀성을 나타내었다(Table 3).

로얄제리 시료에 10-HDA 50, 25, 12.5μg/mL를 첨가하여 회수율 시험을 실시하였고 회수율 ±10% 이내에서 분석법의 정확성을 평가하였다. 그결과각농도에 대한 회수율은 각각 98.1, 96.3, 94.2%로 ±10% 범위내로 나타났으며, 분석방법은 정확성을 가지는 것으로 확인되었다(Table 4).

UHPLC를 사용하여 개발 및 검증된 분석법을 적용하여 경기도 안성, 강원도 철원, 경상남도 진주로부터 채집된 생로얄제리 내 10-HDA의 함량을 평가하였으며, 그 결과를 Table 5에 나타내었다. 강원도 철원에서 채취된 로얄제리 내 10-HDA함량은 29.7±0.3mg/g으로 경기도 안성과 경상남도 진주에서 채취된 로얄제리보다 각각 29%, 34% 높은 것으로 확인되었다. 현재 우리나라 식품공전에 고시된 생로얄제리 내 10-HDA 함량 기준은 1.6% 이상으로 분석한 모든 로얄제리는 기준보다 월등히 높았으며, EU규정인 1.8% 이상보다 더 높은 것으로 확인되었다. 개발된 분석법은 표준시료로 사용한 안성지역의 로얄제리 뿐만 아니라 타지역에서 채취된 로얄제리의 품질평가에 적용이 가능하였으며, 5분 내에 10-HDA를 신속하고 정확하게 분석할 수 있었다.