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Nosema 발생 양상을 확인하기 위하여 사용된 꿀벌은 서양종 꿀벌(A. mellifera)와 동양종 꿀벌(A. cerana) 두 종으로서 농촌진흥청 실험양봉장의 실험봉군에서 시료를 채취하였으며, 서양종 꿀벌(A. mellifera)에서 약제처리를 하지 않은 봉군의 Nosema 발생 양상을 조사하였다(Fig. 1). 이러한 Nosema 발생 정도를 국내 사육종인 서양종 꿀벌(A. mellifera)와 동양종 꿀벌(A. cerana) 두 종간 비교를 위하여 Fig. 1에서 구명된 Nosema 대증식기인 3∼5월동안 봉군별 Nosema 발생을 조사하였다.

Fig. 1. 
Number of Nosema spores in Apis mellifera colonies per monthly.

Nosema 포자수를 확인하기 위하여 봉군별로 채집된 일벌시료의 중장만 해부하여 각각 10마리씩 유발에 멸균수 10ml과 섞어서 곱게 갈고, 약 5분간 정치한 후 상층액의 1μl를 haemocytometer (Superior, German)에 놓고 위상차 현미경으로 400X 배율에서 포자수를 측정하였다.

Nosema 포자를 관찰하기 위하여 사용되고 남은 시료를 14,000rpm으로 5분간 원심분리하여 침전물을 PCR (Polymerase Chain Reaction) template로 사용할 Genomic DNA 분리하는데 사용하였으며, Genomic DNA 분 리 를 위 하 여 Wizard^® Genomic DNA Purification kit (Promega, USA)를 사용하여 분리하였다.

Nosema는 현미경상으로 포자의 크기를 관찰하여 크기가 크면 N. apis, 작으면 N. ceranae로 구별할 수 있으나 일반적인 광학현미경으로는 구분하기가 거의 불가능하거나 매우 어렵다. 따라서 정확한 감염 양상을 확인하기 위하여 16s rDNA primer를 제작하여 각각의 Nosema를 특이적으로 진단할 수 있도록 하였으며, 16s rDNA primer는 Nosema spp.-F; 5′-GGC AGT TAT GGG AAG TAA CA-3′, Nosema spp.-R; 5′-GGT CGT CAC ATT TCA TCT CT-3′, Nosema-ceranae-F; 5′-CGG ATA AAA GAG TCC GTT ACC-3′, Nosemaceranae-R; 5′-TGA GCA GGG TTC TAG GGA T-3′ Nosema-apis-F; 5′-CCA TTG CCG GAT AAG AGA GT- 3′, Nosema-apis-R; 5′-CCA CCA AAA ACT CCC AAG AG-3′를 사용하여 각각 208(Nosema spp.)-nt, 250(Nosemaceranae)-nt, 269(Nosema apis)-nt의 Nosema 16s rDNA가 증폭되도록 PCR 반응은 PTC-200 (MJ research, USA)을 사용하였으며, PCR 반응을 위한 조성은 10pmol의 primer를 1μl씩 사용하여 PCR premix (Bioneer, Korea)를 이용하여 total 20μl로 수행하였으며 template로는 정제된 genomic DNA를 각각 원액, 10배, 30배, 50배로 멸균수를 사용하여 희석한 후 1μl씩 사용하여 total 20μl로 수행하였다. PCR 조건으로는 Predenaturation 95°C 5분, 94°C 30초, 52°C 30초, 72°C 30초로 35 cycle을 반응하고 마지막으로 72°C에서 postpolymerization을 1분간 수행한 후 1.2% Agarose gel에 전기영동 후 확인하였다.

Gene specific primer를 사용하여 증폭된 PCR product의 size가 1.2% Agarose gel을통하여확인된 후Wizard^® SV Gel and PCR Clean-up system (Promega, USA)을 이용하여 정제 후 pGEM^®-T Easy Vector Systems(Promega, USA)을 사용하여 TA-cloning을 수행하였으며, 제한효소 처리와 PCR을 통하여 clone을 선발한 후 DNA-sequencing (ABI 3100)을 통하여 최종적인 염기서열을 확인하였다. 확인된 clone은 NC-16s로 명명하였으며, 결정된 염기서열들은 Clustal X program (V. 1.81) 및 NCBI (National Center for Biotechnological Information)에서 제공되는 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용하여 GenBank에 기록된 모든 유전자 염기서열과 multiple alignment 등의 방법으로 유전자의 상동성 및 특성을 비교·분석하였다.

서양종 꿀벌(A. mellifera)을 사육하는 양봉농가에서는 일반적으로 봄철에 Nosema병 예방 및 치료를 위한 각종 약제를 처리하고 있다. 본 연구에서 확인된 바와 같이 서양종 꿀벌(A. mellifera)에서 Nosema 포자의 발생 및 증감은 계절별 특성을 보이고 있는데, 월동기가 지나고 한 달 정도 경과 후 에 Nosema 포자수가 급격하게 증가하고 있으며, 약 두 달(4월) 정도 경과 후에Nosema 포자수가 최대치에 이른다. 또한 유밀기인 5∼7월경까지 급격하게 포자수가 감소하는 경향을 보이다가 무밀기인 8월∼9월경 약간의 포자 증가 추세를 확인 할 수 있다(Fig. 1). Nosema병은 일반적으로 탈분(화분 배설)을 하는 시기에 벌통근처 및 벌통에 묽은 형태의 탈분을 하는 것과 일벌들이 벌통 근처를 기어 다니는 형태의 병징을 보인다(Afonso C et al., 2012; Holly L Holt et al., 2013). 본 연구의 결과 이러한 증세를 보이는 시기는 일반적으로 Nosema 포자가 이미 최대치에 도달했을 때 양봉장에서 확인할 수 있는 병징으로 이시기에는 약제를 사용하여도 효율적인 Nosema병 방제가 어렵다. 따라서 연중 Nosema병을 적은 비용과 적은 약제의 사용으로 생산물에 대한 약제 잔류 등의 위험까지 줄일 수 있는 방법으로는 봉군이 월동 후 약 한 달 이내에 예방 차원의 Nosema 약제를 사용하는 것이 좋다는 것을 보여준다. 실제 Nosema 포자는 연중 증감을 반복하면서 방제약제를 사용하지 않아도 유밀기에는 포자수가 급격하게 감소하는 것을 확인 할 수 있는데, 이와 같은 현상을 보인다 하더라도 Nosema병의 방제는 필수적으로 수행 되어야 한다. 봄철 Nosema병이 발생한 봉군의 일벌은 외역을 하기 어렵고 봉세가 발달하는 속도가 그렇지 않은 봉군에 비하여 느려서 국내 양봉농가의 주 소득 원인아카시아벌꿀등을생산하는데지장을줄수있다.

연중 Nosema 포자가 가장 많이 증식하는 시기인 봄철(3~5월) Nosema 포자 수 조사 및 감염봉군 조사 결과, 조사 봉군 당 평균 45.8%의 감염율을 보였으며, 포자수는 서양종 꿀벌(A. mellifera) 일벌 한 마리 당 60~95만개의 포자가 관찰되었으며, 평균 73만개의 포자를 가지고 있는 것을 확인하였다. 또한, 동양종 꿀벌(A. cerana) 일벌에서는 평균 62%의 감영봉군 비율을 보이며, 개체 당 60만~350만개의 포자가 관찰되었으며, 평균 240만개의 포자가 관찰되어 서양종 꿀벌(A. mellifera)에 비하여 약 3배 이상의 포자수를 확인 할 수 있었다(Table 1, Fig. 2, Fig. 3). 이러한 결과에 따라서 국내 사육 중인 꿀벌 종인 서양종 꿀벌(A. mellifera)과 동양종 꿀벌(A. cerana)의 Nosema병 발생을 비교하여 보면, 동양종 꿀벌(A. cerana)의 Nosema병의 감염정도가 매우 심각함을 알 수 있다. 2009년 이후 국내 동양종 꿀벌(A. cerana)는 sacbrood virus에 의한 낭충봉아부패병 발생으로 약 90% 정도의 봉군이 폐사하는 상황이 발생하고 그 영향이 최근까지 지속적으로 반복되고 있다. 그러한 관점에서 볼 때 동양종 꿀벌(A. cerana)의 봉군 폐사를 촉진하고 낭충봉아부패병을 더욱 확산시키는 역할을 하는 것으로 Nosema도 중요한 역할을 하는 것으로 추측된다. 금후 동양종 꿀벌(A. cerana)에 대한 Nosema병 방제는 낭충봉아부패병 예방 및 관리 기술과 함께 중요한 방제 대상 질병일 것으로 보이며, Nosema 포자수의 감소를 통한 낭충봉아부패병발생도억제할수있을것으로기대된다.

Fig. 2. 
Comparing of Nosema spores in colony seasonally (Spring) between Apis mellifera and Apis cerana. Mean spores per worker bee during spring season (March to May). Number of Nosema spores was counted by haemocytometer totally 30 worker bee per colony.

Fig. 3. 
Comparing of infection rate of Nosema in colony seasonally (Spring) between Apis mellifera and Apis cerana. Number of Nosema spores was counted by haemocytometer totally 30 worker bee per colony.

일반적으로 Nosema병을 진단하기 위해서는 일벌의 중장을 분리하여 유발에 멸균수와 함께 마쇄 후 haemocytometer를 이용하여 포자 수 측정을 하면서 진단을 하게 되는데, 이는 N. apis와 N. cerana를 구분해서 진단하는 것이 매우 어렵다. 따라서 본 연구에서는 N. apis와 N. cerana를 특이적으로 진단할 수 있는 primer를 제작하여 PCR을 통한 Nosema 진단법을 개발하였다. Gene specific primer를 이용한 PCR에서 N. apis와 N. cerana 두 종을 동시에 진단할 수 있는 primer와 N. apis와 N. cerana를 각각 특이적으로 진단 할 수 있는 primer로 PCR한 결과 본 연구에 사용된 시료에서 N. apis는 진단되지 않았으며, 전체 시료에서 N. cerana만 진단되었다(Fig. 4A). PCR 산물의 염기서열분석결과 primer 부분을 제외하고 210bp의 염기서열(Fig. 4B)을 NCBI BLAST 결과 N. cerana 16s rDNA의 염기서열과 100% 일치함을 확인하였다. 따라서 국내에는 N. apis에 비하여 N. cerana에 의한 Nosema병 발생이대부분이며, N. cerana의약제저항성및질병발생위험성 등에 대한 보고를 바탕으로 볼 때 국내 Nosema병발생에 따른 봉군감소 등의 피해가 예상된다.

Fig. 4. 
PCR and DNA sequence analysis of Nosema spp. (A) PCR amplification of representative bee samples collected from 2013 to 2014 in the RDA. For x-axis, No. 1 indicates that DNA was amplified with generic primers, Nosema F/R; No. 2 indicates DNA was amplified with specific primers, Nosema ceranae F/R; and No. 3 indicates DNA was amplified with specific primers, N. apis F/R, respectively. The primer pairs, Nosema F/R, N. apis F/R, and N. ceranae F/R generated PCR fragments of 208, 250, and 269 bp, respectively. (B) Sequence of N. ceranae. DNA that was extracted from bees collected from apiary in RDA.