Slow Bee Paralysis Virus (SBPV) 신속 검출을 위한 초고속 역전사 중합효소 연쇄반응법의 개발

뒤영벌 시료 확보 및 total RNA의 추출

뒤영벌 시료는 2016년 8월 경기도 수원, 전라남도 보성, 경상북도 청송, 벨기에에서 구입된 서양뒤영벌(Bombus terrestris)을 사용하였다.

Total RNA 분리는 RNAiso Plus Kit (Takara, Japan)를 사용하여 제작자의 지시에 따라 수행하였다. 약술하면, 날개를 제거한 뒤영벌 시료 1마리를 2.0ml tube에 넣고 glass bead (pore size : 1mm, Germany)와 혼합한 후, 1.0ml RNAiso Plus 시약을 넣고 MagNa Lyser (Roche, Switzerland)로 분쇄하였다. 분쇄된 시료에 200μl chloroform을 넣고 15초간 vortexing하여 혼합하였으며, 4°C에서 13,000rpm 10분간 원심분리하여, 상등액만을 1.5ml tube에 옮겼다. 시료상등액과 같은 부피의 isopropyl alcohol을 넣고 15초간 vortexing하여 혼합하였으며, 4°C에서 13,000rpm, 10분간 원심분리하고 상등액을 제거하였다. RNA 침전물은 75% ethanol을 사용하여 washing 과정을 진행한 후, DEPC 처리된 증류수를 사용하여 total RNA의 용액으로 확보하였다. 추출된 total RNA는 Biophotometer (Eppendorf Co., Germany)를 사용하여 OD260 (Optical Density 260nm)으로 정량하였고 -70°C에 보관하며 이후 실험에 사용하였다.

SBPV 특이 유전자의 재조합 DNA 제작 및 Primer 선별

SBPV 특이 유전자 재조합 DNA (pSBPV-329)는 경기대학교 생명과학과 분자생물학 연구실에 확보된 것을 사용하였으며, 여러 SBPV primer 쌍 중 Ultrarapid PCR에 최적인 primer를 선별하여 사용하였다. 유전자 정보 및 참고문헌은 Table 1과 Supplement Table S1에 나타내었다.

Table 1.

Slow bee paralysis virus specific primers information

SBPV 특이 유전자 초고속 검출을 위한 PCR 조건 최적화

초고속 PCR의 최적화를 위하여, 주형으로 재조합 DNA pSBPV-329를 사용하였으며, OD260으로 정량한 후, 1.0×10⁵ 분자를 기준으로 초고속 PCR에 사용하였다. 초고속 PCR을 위한 Thermocycler는 GENECHECKER(Gene System Co., Korea)를 사용하였으며, 초고속 PCR의 온도 및 시간 조건은 95°C 초기 변성 15초 후, 95°C 변성 3초, 혼성 3초, 72°C 중합 3초를 기준으로 하였고, 총 50 회전을 진행하였다. 최적 annealing 온도는 50~65°C 범위에서 구하였으며, 최적의 primer 농도는 10μM, 8μM, 4μM, 2μM, 1μM, 0.5μM, 0.25μM에서 각기C_T (Threshold Cycles)값과 최대 형광값의 측정으로 조정하였다.

SBPV 특이 유전자의 최소 검출 시간에 따른 검출 한계 측정

SBPV 특이 초고속 PCR의 최소 검출 시간에서 특이 검출의 한계를 측정하기 위하여 초고속 PCR의 각 회전 중 혼성, 중합의 시간을 각각 3초에서 1초까지 감소시켜 각 온도와 시간 조건에 따른 C_T 값과 C_T 값이 측정되는 시간(C_T time)을 측정하였다. 이 측정에서는 재조합 DNA인 pSBPV-329를 1.0×10⁸ 분자부터 1.0×10⁰ 분자까지 연속 희석하여, 초고속 PCR의 주형으로 사용하였으며, 초고속 PCR의 각 단계에서 시간 및 온도 조건도 가감하여, SBPV 특이 초고속 PCR이 최소 검출 시간 내에 검출 가능한 최소 한계를 추구하였다.

뒤영벌 gDNA 존재하에 SBPV 특이 초고속 PCR의 검출한계 및 정량 범위

뒤영벌 gDNA 존재하에 SBPV 검출한계를 측정하기 위하여, SBPV 에서 추출한 핵산을 주형으로 SBPV 특이 유전자의 증폭량을 확인하였다. PCR 반응은 5μl의 2 × Rapi master mix와 1μl씩의 SBPV F/SBPV-C3G peptidase R (최종 농도 2μM) primer에 뒤영벌 gDNA(100ng)를 첨가하여 총 10μl로 조성하여 수행하였으며, 초고속 PCR의 각 단계에서 시간 및 온도 조건은 앞선 실험의 최적화한 조건에 근거하여, 95°C 초기 변성 15초 후, 95°C 변성 1초, 59°C 혼성 2초, 72°C 중합 1초를 표준으로 하였고, 총 50 회전을 진행하였다.

국내 뒤영벌에서 SBPV 특이 초고속 RT-PCR을 적용한 검출

국내에 판매되고 있는 서양뒤영벌의 SBPV 감염여부를 판단하기 위하여, 경기도 수원, 전라남도 보성, 경상북도 청송, 벨기에에서 생산된 뒤영벌 각 1마리에 대하여 Total RNA를 분리하였다. Total RNA는 각 100ng을 사용하여 뒤영벌에 대하여 SBPV 특이 초고속 역전사 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 5μl의 2×Rapi RT master mix와 1μl씩의 SBPV F/SBPV-C3G peptidase R (최종 농도 2μM) primer로 총 10μl로 조성하여 수행하였다. SBPV 특이 초고속 역전사 PCR은 GENECHECKER (Gene System Co., Korea)를 사용하였으며, 최적화된 PCR의 온도 및 시간 조건은 50°C, 1분 역전사 반응 후, 95°C, 15초 초기 변성, 95°C 1초 변성, 59°C, 2초 혼성, 72°C, 1초 중합을 1회전으로 하여 총 50 회전을 진행하였다.

SBPV 특이 유전자 초고속 검출을 위한 PCR 조건 최적화

SBPV 특이 초고속 PCR에서 최적의 혼성 온도를 파악하고자 재조합 DNA 1.0×10⁵ 분자의 pSBPV-329를 사용하였으며, 초고속 PCR의 온도 및 시간 조건은 95°C 초기 변성 15초 후, 95°C 변성 3초, 50~65°C 혼성 3초, 72°C 중합 3초를 표준으로 총 50 회전 진행하였다.

SBPV 특이 유전자 초고속 검출가능의 온도는 53~65°C의 범위이며, 50°C의 경우, 정량적 검출이 어려워 최적조건 정립에서 제외하였다. 가장 빠른 C_T는 혼성 온도 59°C일 때 23.14 회전으로 측정되었으며, 이에 이르기까지 소요된 PCR 진행 시간(C_T time)은 8분 22초이었다. 따라서 SBPV 특이 초고속 PCR에서 최적 혼성 온도는 최저 C_T 값 및 C_T time, 그리고 최종 형광값(증폭량, F=262) 모두에서 우수한 결과를 보인 59°C로 결정하였다(자료 미제시).

또한, 초고속 PCR에서 SBPV 특이 primer의 최적 농도를 구하기 위하여 재조합 DNA 1.0×10⁵ 분자의 pSBPV-329를 사용하였으며, 각 10μM, 8μM, 4μM, 2μM, 1μM, 0.5μM, 0.25μM(각 최종농도)의 농도의 primer를 각각 사용하여 실험하였다. 특이 primer의 최적 농도는 가장 빠른 C_T 값과 최종 형광값을 기준으로 판단하였다.

고농도, 즉 10μM와 8μM의 primer를 사용한 초고속 PCR은 각각 7.96, 8.39 회전의 빠른 C_T 값을 보였고, 최종 형광값 또한 우수한 수준으로 측정되었다. 이고농도 primer의 초고속 PCR은 4μM 또는 2μM의 중농도 primer를 사용한 초고속 PCR보다 12 회전이상 빠른 C_T 값을 보인 것으로, 이는 1.0×10¹ 분자 이내의 극미량 초기 주형에 대한 증폭에서 보다 유리할 것으로 판단되었다. 그러나, 이 고농도 primer는 초고속 PCR의 안정성에서 불안정한 면을 보였으며, 1.0×10⁵ 분자 이상의 초기 주형을 사용하였을 경우 정량성이 현저히 떨어지는 것으로 나타났다(자료 미제시).

이런 이유 등으로 SBPV 특이 초고속 PCR에서 최적 primer의 농도는 C_T (22.08 회전)와 C_T time (7분 59초)에서 빠른 검출시간을 보였으며, 최종 형광값(262) 모두에서 우수한 결과를 보인 2μM을 최적 primer 농도로 결정하였다(Fig. 1).

Fig. 1.

Optimization of primer concentration using SBPV-specific Ultra-rapid PCR. Using various concentrations of primers, optimal concentration of SBPV-specific primer were selected for Ultra-rapid PCR. At the final concentrations of 10μM and 8μM of primer, Ultra-rapid PCR showed the fastest CT values of 7.96 and 8.39 cycles and the final fluorescence values were also measured to be excellent. However, when the concentration of the primer was set to 10μM and 8μM, the CT values were unstable and no exact quantitative manner using higher numbers than 1.0×105 SBPV-specific molecules, as initial template. Based on these reasons, optimal concentration of specific primer was selected as 2μM each (CT=22.08, CT time=7min 59sec, F=262).

SBPV 특이 유전자의 최소 검출 시간에 따른 검출 한계 측정

PCR의 각 단계 시간 단축은 초고속 검출에 있어서 전체 검사 시간을 줄일 수 있는 가장 중요한 요소로써 작용한다. SBPV 유전자의 최단 검출 시간을 위해, PCR 각 단계(혼성, 중합)의 시간을 3초에서 1초까지 조절하여 초고속 PCR을 시행하였고 변성시간은 1초로 고정하여 초고속PCR을 수행하였다.

1.0×10³ 분자인 pSBPV-329를 기질로 사용한 초고속 PCR에서 각 회전의 혼성시간을 3초에서 1초까지 조정한 결과, 각C_T 값은 3초에서 28.92 회전(C_T time=9분 37초), 2초에서 29.89 회전(C_T time= 9분 30초)으로 측정되었으며 SBPV 특이 유전자의 증폭을 확인할 수 있었다. 혼성시간이 1초일 경우, DNA 증폭을 나타내는 형광곡선이 1.0×10⁸ 분자부터 1.0×10⁰ 분자까지 동일한 C_T 값인 6 회전에서 동시에 증폭됨을 볼 수 있어 정량적 측정이 불완전하다고 판단하였다. 같은 조건에서 각 혼성시간만 3초와 2초로 감소시킨 초고속 PCR을 비교한 결과, 해당 C_T 값이 혼성시간이 짧아질수록 증가하는 결과를 보여주었으며, C_T time은 혼성시간 2초에서 9분 30초로 혼성시간 3초와 비교했을 때, 7초 차이로 감소세를 보였다. 따라서 혼성시간을 3초에서 1초로 조정하여 비교하였을 때의 검출 가능 최소 혼성시간은 2초로 판단되었다.

1.0×10³ 분자인 pSBPV-329를 기질로 사용한 초고속 PCR에서 각 회전의 중합시간을 3초에서 1초까지 조정한 결과, 각 C_T 값은 3초에서 29.89 회전(C_T time= 9분 30초), 2초에서 29.97 회전(C_T time= 9분 1초), 1초에서 30.02 회전(C_T time= 8분 31초)으로 측정되었으며 SBPV 특이 유전자의 증폭을 확인할 수 있었다. 같은 조건에서 각 중합시간만 3초, 2초, 1초로 감소시켰을 때, 해당 C_T 값은 중합시간이 짧아질수록 증가하는 결과를 보여주었으나, C_T time에서는 점차 감소하는 양상을 보였다. C_T time은 중합시간 1초에서 8분 31초로 중합 시간 3초와 비교했을 때, 59초 차이로 큰 감소세를 보였다. 따라서 중합시간을 3초에서 1초로 조정하여 비교하였을 때의 검출 가능 최소 중합시간은 1초로 판단되었다(Fig. 2).

Fig. 2.

Minimum time of annealing and/or polymerization in SBPV-specific Ultra-rapid PCR. The annealing time and polymerization time were shortened to set the minimum detection time in SBPV-specific Ultra-rapid PCR. Denaturation step was fixed at 1 sec in each cycle of PCR and the times of annealing step and/or polymerization step were shortened from 3 sec to 1 sec.

한편, 변성, 혼성, 중합시간을 각 1초, 2초, 1초로 단축한 결과, DNA 증폭을 나타내는 형광곡선은 초기주형량에 따라 정상적인 증가를 보여주었으며 1.0×10¹ 분자까지 SBPV 특이 유전자의 증폭을 확인할 수 있었고 1.0×10² 분자까지 정량적으로 검출됨을 확인하였다. 또한 혼성시간을 1초 조정한 1초, 1초, 3초 조건으로 하였을 때, DNA 증폭을 나타내는 형광곡선이 1.0×10⁸ 분자부터 1.0×10⁰ 분자까지 동일한 C_T 값에서 동시에 증폭됨을 볼 수 있어 정량적 측정이 불가능하다고 판단하였다(Supplement Fig. S1).

따라서 SBPV 특이 초고속 PCR은 PCR 시스템의 안정성 또한 고려하여 각 회전의 변성, 혼합, 중합 시간을 각각1초, 2초, 1초로 수행하였다.

또한, SBPV 특이 초고속 PCR에서 SBPV 유전자의 특이 증폭을 위한 최소 검출 시간을 측정하였다. 1.0×10⁸ pSBPV-329 분자를 주형으로 사용하였으며, 최적화된 SBPV 특이 초고속 PCR의 조성으로, 최적화 된 온도조건하에 각 변성, 혼성, 중합 시간을 각 1초, 2초, 1초로 설정하고 50 회전을 수행하였다. 초기 변성 15초 후, 12.60 회전만에 C_T line에 도달하였으며, C_T time은 3분 35초였다. 37 회전(C_T time은 10분 31초) 전후에 최대 형광값을 보여주었으며, 50 회전의 초고속 PCR은 15분 45초에 종료되었다(Supplement Table S2).

SBPV 특이 초고속 PCR의 검출한계 및 정량 범위

SBPV 특이 초고속 PCR의 안정적 시간 조건(각 회전 중 변성, 혼성, 중합시간 각 1초, 2초, 1초)에서 SBPV 유전자의 최소 검출한계를 확인하였다. SBPV 특이 유전자 재조합 DNA 1.0×10⁸ 분자를 연속 희석하여, 1.0×10⁰ 분자까지 초고속 PCR의 주형으로 사용하여 각 초기주형수에 따른 검출한계를 측정하였다(Fig. 3).

Fig. 3.

Detection limit of SBPV-specific Ultra-rapid real-time PCR with 10-fold diluted specific DNAs. The detection limit of SBPV gene was estimated using SBPV specific Ultra-rapid PCR under the minimum times of thermocycling (1 sec of denaturation, 2 sec of annealing, 1 sec of polymerization in single cycles). Until 1.0×101 molecules of pSBPV-329, specific products were amplified, respectively. Tms of all PCR products were measured as 80.45±1.15°C, except 1.0 ×100 molecule and PCR product using non template.

상기 조건에서 SBPV 유전자는 1.0×10¹ 분자의 초기 주형에서도 성공적으로 증폭이 가능함을 보여 주었다. 10배씩 감소시킨 초기분자량 간의C_T 값의 차이를 dC_T10 라 정의하며, 1.0×10⁸ 분자에서 1.0×10² 분자까지의 평균 dC_T 값은 약 3.20 회전으로 계산되었다. 1.0×10¹ 분자의 초기 주형에서 평균C_T 값은 40.74회전이었고, 평균 C_T time은 11분 45초이었고, Tm 값 또한 79.63°C로 SBPV의 유효범위에 포함되었다. 따라서 안정적인 검출에 필요한 주형의 양은 1.0×10¹ 분자 이상이라 판단하였다.

SBPV 특이 유전자 대신 증류수를 넣어준 SBPV 특이 초고속 PCR (N; non-template, Fig. 4)은 19 회전 부근에서 C_T line을 넘는 증폭이 관찰되었으나, 이 Tm 값은 측정되지도 않는 낮은 수준의 산물을 생성한 것으로 보이며, 이는 특이적 증폭이 아닌 것으로 판단할 수 있었다. 또한 1.0×10⁰ 분자의 증폭에서도 46 회전부근에서 C_T line을 넘는 증폭이 관찰되었으나 이 또한 Tm 값이 그래프상에서 측정되지도 않아 특이적 증폭이 아닌 것으로 판단하였다.

Fig. 4.

Regression equation based on SBPV molecules and CT using SBPV-specific Ultra-rapid PCR. dCT indicates difference between each CT values (cycles) of PCRs using 10-fold diluted initial templates. Means of dCT10 is 3.20±1.49 cycles. Quantitative measurement was possible from 1.0×108 molecules to 1.0×102 molecules. At the detection limit in the presence of bumblebee gDNA, means of dCT10 is 3.43 ±0.55 cycles. Quantitative measurement was possible from 1.0×108 molecules to 1.0×101 molecules.

한편, 재조합 DNA인 pSBPV-329를 사용한 초고속 PCR에서 연속 희석된 주형 DNA의 양에 따라 각 C_T값이 측정되었으며, 이에 따른 회귀식(Regression equation)은 y=-3.2586x + 39.234 (y=초기 SBPV의 분자수)로, 이 때 회귀 상수(Regression coefficient)는 R²=0.9900이었다.

또한, 정확한 정량을 위한 정량 가능 범위는 주형 DNA가 1.0×10² 분자 이상 1.0×10⁸ 분자까지라 판단하였으며, 이를 정량가능범위로 정하였다(Fig. 4).

뒤영벌 gDNA 존재하에 SBPV 특이 초고속 PCR의 검출한계 및 정량 범위

뒤영벌 gDNA 존재하에 SBPV 특이 초고속 PCR의 안정적 시간 조건(각 회전 중 변성, 혼성, 중합시간 각 1초, 2초, 1초)에서 SBPV 유전자의 최소 검출한계를 확인하였다. 100ng의 뒤영벌 gDNA와 함께 SBPV 특이 유전자 재조합 DNA 1.0×10⁸를 연속 희석하여, 1.0×10⁰ 분자까지 초고속 PCR의 주형으로 사용하여 검출한계를 측정하였다(Fig. 5).

Fig. 5.

Detection limit of SBPV-specific Ultra-rapid real-time PCR with 10-fold serial diluted specific DNAs with gDNA of bumblebee. The detection limit of SBPV specific genes with gDNA of bumblebee was estimated using SBPV specific Ultra-rapid real-time PCR under the minimum times of thermocycling (1 sec of denaturation, 2 sec of annealing, 1 sec of polymerization in each cycle). As initial template, until 1.0×101 molecules of pSBPV-329 was also amplified. Tms of all PCR products were measured as 80.47±1.32°C, except PCR products from 1.0×100 molecule and non template.

100ng 뒤영벌 gDNA의 존재하에서도 SBPV 특이 유전자는, 1.0×10¹ 분자의 초기 주형까지, 성공적으로 증폭되었다. 초기주형의 분자수를 10배 희석시킨 PCR의 C_T 값 차이인, dC_T10을 각기 계산하였으며, 1.0×10⁸ 초기 주형 분자에서 1.0×10¹ 분자까지 계산된 각 dC_T10의 평균 dC_T10 값은 약 3.43 회전으로 계산되었다. 이는 뒤영벌 gDNA의 첨가없이 수행된 같은 초고속 PCR결과(Fig. 3 및 Fig. 4)와 매우 유사한 값으로, SBPV-특이 초고속 PCR은 초기 주형에 100ng 뒤영벌 gDNA를 사용한 것과 정량 및 정성의 면에서 무관하며, 간섭이 없었음을 보여주었다.

증류수 만을 초기 주형 대신 사용한 SBPV 특이 초고속 PCR은 34 회전 부근에서 C_T line을 넘는 증폭이 관찰되었으나(N; non-template, Fig. 5), 융점 분석을 통해 SBPV의 유효범위인 80.47°C와 큰 차이를 보이는 78.49°C로 측정되어 특이적 증폭이 아님을 쉽게 확인할 수 있었다. 1.0×10⁰ 분자의 SBPV 특이주형에서도 증폭함을 확인하였으나 융점 분석을 통해 SBPV의 유효범위인 80.47°C와 큰차이를 보이는 73.87°C로 측정되어 특이적 증폭이 아님을 쉽게 확인할 수 있었다.

뒤영벌 gDNA 100ng의 존재하에, 연속 희석된 재조합 DNA pSBPV-329를 사용한 SBPV 특이 초고속 PCR에서 각 C_T 값이 측정되었으며, 이에 따른 회귀식(Regression equation)은 y=-3.4602x+39.916 (y=초기 SBPV의 분자수)로, 회귀 상수(Regression coefficient)는 R²=0.9985이었다(Fig. 4).

SBPV 감염 의심 뒤영벌 사체에서의 SBPV 특이 초고속 RT-PCR을 통한 검출

SBPV 특이 초고속 PCR의 현장 적용성을 검증하기 위하여, SBPV 감염이 추정되는 국내외 생산 뒤영벌 시료들로부터 total RNA를 분리하였으며, 해당 뒤영벌 한 마리로부터 회수한 total RNA 100ng을 사용하여 SBPV 특이 초고속 RT-PCR을 수행하였다. 결과로써, SBPV 감염이 추정되던 시료들 중 일부, 벨기에 수입 뒤영벌, 그리고 국내 생산 1개 시료로부터 SBPV 존재에 대한 양성반응을 판정할 수 있었다(Fig. 6).

Fig. 6.

SBPV specific UR-RT PCR with various bumblebee samples. UR-PCR was performed with 100ng total RNA from each sample as inital templates. The Reverse transcription condition was 50°C, 1 min and the PCR condtion was 95°C, 15 sec of pre-denaturation, 95°C, 1 sec of denaturation, 59°C, 2 sec of annealing, 72°C, 1 sec of polymerization in each cycle for 50 cycles. SBPV specific gene was amplified from the samples of Belgium and Suwon. Panel A is the fluorescent graph of amplification and the peak graph of Tm of each amplicon. Panel B is amplified DNAs on the agorose gel. Lane 1 is sample from Suwon. Lane 2 is from Boseong. Lane 3 is Cheongsong. Lane 4 is Belgium sample. Lane 5, 6 are 1.0×105 molecules and 1.0 ×102 molecules of pSBPV-329, respectively. Lane 7 is nontemplate.

SBPV 특이 초고속 PCR 결과, 수원(Suwon)과 벨기에(Belgium)에서 생산된 뒤영벌 시료에서 SBPV 특이 유전자 증폭이 관찰되었으며, 각 산물의 융점분석에서 SBPV 특이 유전자의 증폭으로 판단되었다. 측정된 SBPV의 Tm 값은 수원 79.48°C, 벨기에 79.15로, SBPV의 양성 증폭의 유효범위(80.47±1.32°C) 안에 해당함으로 SBPV 유전자의 증폭으로 판정한 것이다(Table 2).

Table 2.

CT and Tm value of SBPV-specific UR-PCR with bumblebee sample

뒤영벌 사체에 포함되어 있는 SBPV 양은 Fig. 5의 회귀식에 기반하여 계산한 결과, 수원은 4.76×10³ 분자/마리, 벨기에는 4.82×10³ 분자/마리로 계산되었으며, 상기의 결과는 SBPV가 국내에서 판매되고 있는 뒤영벌의 사체에 실제로 존재함을 보여주는 것이다.

본 PCR법을 뒤영벌 사육 현장에서 보다 쉽게 사용하기 위해서는, 성봉 또는 유충으로부터 보다 간소화된 핵산 추출법의 개발이 필요로 하며, 이러한 간편 핵산 추출법과 본 초고속 RT-PCR법이 연합될 수 있다면, 바로 현장에서 유전자 검사를 빠르게 수행하여 SBPV의 감염여부를 수 분 내에 판정할 수 있을 것이다. 더 나아가 뒤영벌의 다른 바이러스에 대하여 현장성을 보안한 신속한 검출법 개발로 연구가 확장될 것으로 기대하며 뒤영벌 수출입을 위한 검역 기준을 이용하여 집단적 발병 방지에 기여할 수 있기를 기대한다.