실내 월동 온도 조건에 의한 양봉꿀벌의 월동 능력과 면역 관련 유전자 발현 분석

서 론

꿀벌은 전 세계적으로 다양한 양봉 산물의 제공과 더불어 약 75%에 해당하는 경제 작물의 화분 매개를 담당하는 인류에게 매우 중요한 곤충 자원이며 국내에서도 지속적으로 양봉 농가의 수가 증가하고 있다. 해충 및 질병의 발생, 기후 변화 등에 의한 봉군의 피해는 매년 농가에 피해를 유발하기 때문에 봉군 피해 감소를 위하여 먹이, 온도, 습도, 해충, 질병 등 봉군의 생태와 관련된 요인에 대한 다양한 관리법들이 개선 및 개발되고 있다. 봉군 관리 기술은 꿀 채취, 로열젤리 채취, 꽃가루 채취, 여왕벌 생산 등 각각의 목적에 최적화된 봉군 상태 유지에도 필요하지만, 이를 위해서는 기본적으로 최상의 봉군 상태 유지를 위한 계절별, 상황별 사육 기술이 바탕이 되어야 한다. 사계절이 뚜렷한 국내의 기본적 봉군 관리를 위한 주요 행사로는 월동 (11월~2월), 봄 벌 깨우기 (1~2월), 혹서기 (7월~8월), 월동 준비 (10~11월)가 있다. 이 중에서도 대부분의 지역에서 영하권의 기온을 보이는 겨울 시기를 버티는 월동은 꿀벌의 생활사에서 매우 중요한 행사이다.

꿀벌의 월동에 있어 가장 중요한 요소는 온도이다. 월동기간 동안 벌들은 봉군 내에 서로 빼곡히 모여 봉구를 형성하고 열을 발생하여 30℃ 이상의 온도를 유지한다 (Southwick, 1985; Stabentheiner et al., 2010). 봉구는 외부의 기온에 따라 신축하게 되는데, 이상 기후 현상에 의하여 단기간 내에 오르내리는 기온 변화는 봉구를 다발적으로 신축하게 하고 봉군 폐사의 확률을 높인다. 항온 저온 시설을 이용한 꿀벌의 월동은 봉구의 신축을 최소화하여 월동기간 봉군의 열손실을 감소할 수 있고, 이는 일벌의 개체수 유지에 도움이 될 것으로 생각된다. 월동기간 개체군이 높은 밀도로 유지된 봉군은 새로운 한 해를 위한 일벌의 육아 및 먹이 활동을 안정적으로 수행하여 세력이 강한 봉군으로 성장하고, 결과적으로 한 해의 양봉 농사를 결정 짓는 요인으로 작용할 수 있기 때문에 항온 저온 창고를 이용한 실내 월동의 필요성이 대두되고 있다. 봉군 외부 온도 변화 정도를 감소시킬 수 있는 저온창고 내 월동법이 고안되었지만 (최 등, 2001) 현재까지 온도, 습도 등의 요인에 대한 연구는 부족한 실정이다.

곤충은 후천 면역 시스템 (Adaptive immune system) 없이 잘 발달한 세포성 면역 (Humoral immunity)과 체액성 면역 (Cellular immunity)으로 구성된 내재 면역 시스템 (Innate immune system)으로 기생충, 바이러스, 박테리아 등에 대응한다 (Lavine and Strand, 2002; Evans et al., 2006).

곤충의 내재 면역 시스템 중 체액성 면역은 외부 침입 물질에 다양하게 반응하는 Toll, immune deficiency (IMD), c-Jun N-terminal kinases (JNK) and Janus kinase-signaling transducer and activator of transcription (JAK/STAT) pathway에 의하여 조절되고, defensin 1 (Def1)과 hymenoptaecin과 같은 항생물질의 발현을 담당한다 (Evans et al., 2006).

세포성 면역은 혈구 (Haemocytes)에 의하여 조절되며 phagocytosis, nodulation, encapsulation과 같은 반응을 한다 (Strand and Pech, 1995). Nodulation과 encapsulation은 melanization을 수반하는데 (Söderhäll and Cerenius, 1998) pro-phenoloxidase (PPO)가 촉매 역할을 한다 (Shiao et al., 2001; Lourenço et al., 2005).

꿀벌은 초봄부터 늦여름 사이에 태어나 내역과 외역을 담당하며 약 30~40일을 사는 여름벌 (Summer bees)과 늦여름부터 초가을 사이에 태어나 겨울을 보내는 동안 봉군 내부의 온도를 유지하고 새로운 봄을 맞이하여 육아를 담당하며 약 80~160일을 생존하는 겨울벌 (Winter bees)이 각각 다른 생리적 특징으로 서로 다른 계절을 담당한다 (Maurizio and Hodges, 1950; Fukuda and Sekiguchi, 1966; Mattila et al., 2001). 겨울을 생존하기 위한 꿀벌의 전략으로 대부분의 생리 활성을 떨어뜨리고, Def1, PPO, eater 등 대부분의 면역관련 유전자 역시 겨울벌에서 여름벌보다 발현이 억제된다 (Steinmann et al., 2015).

Juvenile hormone (JH)과 Vitellogenin (Vg)은 꿀벌 생리에 중요한 역할을 담당한다. 꿀벌 JH 발현의 증가는 Vg 발현을 억제하고 (Pinto et al., 2000; Amdam et al., 2005), 이들의 상호 보완적인 조절은 꿀벌의 생식, 계급 분화, 수명, 발달, 행동 등과 관련이 있으며 꿀벌의 나이와 계절벌에 따라서 발현의 차이가 나타난다 (Engels et al., 1990; Huang and Robinson, 1995; Amdam et al., 2003a; Amdam et al., 2003b; Corona et al., 2007; Steinmann et al., 2015).

본 연구에서는 항온 저온 창고를 활용한 양봉꿀벌 (Apis mellifera) 월동의 이점을 확인하고자, 항온 저온 창고 내에서 실내 월동한 봉군 및 노지에서 야외 월동한 봉군의 무게를 조사하여 월동 능력을 비교하였다. 또한 각 월동 조건별 봉군의 생리 상태를 비교하기 위해서 월동기간 중 꿀벌 시료를 채집하였고 면역 관련 유전자의 발현을 비교하였다.

재료 및 방법

4. 유전자 발현 비교를 위한 real-time PCR

각 유전자의 전사체 발현 정도를 측정하기 위하여 qPCR을 수행하였다. 조건별 채집 일벌 샘플 50마리를 막자사발과 액체질소를 이용하여 균질화하고 RNA extraction kit (QIAGEN, Hilden, Germany)로 total RNA를 추출하였다. 잔여 genomic DNA 제거를 위하여 추출한 total RNA에 DNaseI (TAKARA Korea Biomedical Inc., Seoul, Korea)을 처리하였다. 이 후 2.5 μg의 total RNA를 amfiRivert Platinum cDNA synthesis enzyme (GenDEPOT, TX, USA)로 cDNA 합성에 사용하였다.

실험에 사용한 꿀벌 면역 유전자로 catalase (NM_0011 78069.1), superoxide dismutase (Sod, NM_001178027.1), PPO (AY242387.2), Def1 (NM_001011616.2), defensin 2 (Def2), hymenoptaecin (U15956.1), abaecin (NM_0010 11617.1), apidaecin을, 수명 관련 유전자는 Vg 그리고 JH 발현의 지표가 되는 methyl farnesoate epoxidase (mfe, XM_623572)를 사용하였다.

각 유전자 특이적인 PCR primer를 합성하여 qPCR에 사용하였다 (Table 1). qPCR에는 AccuPower 2X GreenStar qPCR Master Mix (BIONEER, Daedeok, Korea)를 사용하였고, 95℃ 10분, 40 반복의 95℃ 15초, 58℃ 1분의 온도 프로그램으로 QuantStudio5 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에서 유전자의 증폭이 수행되었다. Reference 유전자로 actin related protein 1 (ARP1, NM_001185146.1)을 사용하였다.

Table 1.

Primers of the genes for qPCR

결 과

1. 월동 조건별 봉군의 무게 변화

월동 지역 및 실내 월동 온도에 따라 월동기간 중 봉군의 상태 변화를 판단하기 위하여 봉군 무게를 측정하였다. 4℃ 저온 창고에서 월동한 봉군은 월동 전 평균 19.97±1.51 kg에서 월동 후 평균 17.83±1.38 kg으로 (t(12)=2.8, p=0.017) 평균 2.14±0.3 kg이 감소하여 10.71%의 무게 감소율을 보였다 (Fig. 1). 1℃ 저온 창고에서 월동한 봉군은 월동 전 평균 18.84±1.38 kg에서 월동 후 평균 16.35±1.39 kg으로 (t(12)=3.4, p=0.0057) 평균 2.49±0.17 kg이 감소하여 13.19%의 무게 감소율을 보였다 (Fig. 1). 저온 창고 월동의 대조군인 실외 월동 실험군 중 국립농업과학원 양봉장 (전북 완주군 이서면)에서 월동한 봉군은 월동 전 평균 19.20±1.16 kg에서 월동 후 평균 16.39±1.02 kg으로 (t(12)=4.8, p=0.0004) 평균 2.81±0.76 kg이 감소하여 14.63%의 무게 감소율을 보였으며 위도 꿀벌 격리육종장 (전북 부안군 위도면)에서 월동한 봉군의 경우 월동 전 평균 20.22±1.15 kg에서 월동 후 평균 17.41±1.14 kg으로 (t(12)=4.6, p=0.0006) 평균 2.82±0.36 kg이 감소하여 13.93%의 무게 감소율을 보였다 (Fig. 1). 종합하면 야외 (완주, 위도) 월동 봉군과 1℃ 저온 창고 월동 봉군의 무게 감소율은 순서대로 14.63%, 13.93%, 13.19%로 유의미한 차이를 보이지 않았지만, 4℃ 저온 창고 월동 봉군의 월동 중 무게 감소율은 10.71%로 다른 월동 시험군 대비 유의미하게 낮은 무게 감소율을 보였다.

Fig. 1.

Changes of the honey bee colony weight during wintering depending on the wintering condition. Colonies weight were measured before wintering (Nov. 24, 2020) and after wintering (Mar. 02, 2021). 4℃: Honey bees wintering in the warehouse where the temperature is 4°C. 1°C: Honey bees wintering in the warehouse where the temperature is 1°C. WJ: Honey bees wintering in Jeollabuk-do Wanju-gun. WD: Honey bees wintering in Wido island. Statistics performed by unpaired t-test, comparing each group of colony weights measured before wintering to that of measured after wintering. *p>0.05, **p>0.01, ***p>0.001.

2. 월동 조건별 꿀벌 면역 및 수명 관련 유전자 발현 변화

월동 조건에 따른 꿀벌 봉군 면역력을 판단하기 위하여 월동기간별 일벌의 주요 면역 관련 유전자의 상대적 발현양을 비교하였다.

세포성 면역 시스템에 관여하는 sod, catalase, PPO 전사체의 발현은 월동 중 억제되었고, 월동 종료 후 약 2주가 지난 시점에서 재발현 되었다 (Fig. 2).

Fig. 2.

Transcriptional expression level of honey bee immune-related genes. X-axis is the sample collection dates during the winter season of 2020~2021. WJ: Honey bees wintering in Jeollabuk-do Wanju-gun. WD: Honey bees wintering in Wido island. 4°C: Honey bees wintering in the warehouse where the temperature is 4°C. 1°C: Honey bees wintering in the warehouse where the temperature is 1°C.

혈림프 활성 (Hemolymph activity)을 갖는 항균 펩티드 (Antimicrobial peptide; AMPs)의 경우 Def1을 제외한 나머지 펩티드의 유전자인 Def2, Hymenoptaecin, Abaecin, Apidaecin의 발현이 월동 중 억제되었으며 월동이 종료되는 3월경 재개되었다. Def1은 월동 중 발현이 점차적으로 증가한 뒤 월동이 종료되는 3월부터 발현이 억제되며 다른 항균 펩티드의 발현과 반대되는 패턴을 보였다 (Fig. 2).

꿀벌의 수명과 관련있는 Vg 전사체는 월동 중 오르내리는 발현 패턴을 보였으며 월동이 종료되는 3월에 발현이 억제되었다. 꿀벌 JH의 발현을 나타낼 수 있는 대체 유전자인 mfe 전사체의 발현은 Vg와 반대로 월동 중 억제상태를 유지한 뒤 월동이 끝나는 3월에 발현을 재개하였다 (Fig. 3).

Fig. 3.

Transcriptional expression level of the honey bee lifespan-related genes. X-axis is the sample collection dates during the winter season of 2020~2021. WJ: Honey bees wintering in Jeollabuk-do Wanju-gun. WD: Honey bees wintering in Wido island. 4°C: Honey bees wintering in the warehouse where the temperature is 4°C. 1°C: Honey bees wintering in the warehouse where the temperature is 1°C.

고 찰

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 연구과제 PJ01476105의 연구비로 지원된 결과이다.

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