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The APICULTURAL SOCIETY OF KOREA
[ Original research article ]
Journal of Apiculture - Vol. 36, No. 3, pp.177-181
ISSN: 1225-0252 (Print)
Print publication date 30 Sep 2021
Received 31 Aug 2021 Revised 13 Sep 2021 Accepted 23 Sep 2021
DOI: https://doi.org/10.17519/apiculture.2021.09.36.3.177

서양종꿀벌이 수집한 소나무 화분의 항산화 활성

이혜진 ; 한상미 ; 우순옥 ; 김효영 ; 김선미 ; 최홍민 ; 문효정 ; 김세건*
농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부
Antioxidant Activity of Pinus densiflora Pollen Collected by Apis mellifera
Hye-Jin Lee ; Sang-Mi Han ; Soon-Ok Woo ; Hyo-Young Kim ; Seonmi Kim ; Hong-Min Choi ; Hyo-Jung Moon ; Se-Gun Kim*
Department of Agricultural Biology, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Wanju 55365, Republic of Korea

Correspondence to: * E-mail: kimsegun@korea.kr

Abstract

Bee pollen is an accumulation of honey and enzymes from the hind legs when honeybees collect nectar from flowers, and has been reported to be rich in nutrients and have antioxidant capacity. However, there are insufficient reports on the functionality of Pinus densiflora pollen collected by Apis mellifera. To evaluate the functionality, antioxidant activities by DPPH, ABTS, and FRAP assays were performed. In addition, the amount of total polyphenol and total flavonoid contents were examined. As a result of examining the antioxidant activities of the bee pollen extract by 3 different concentrations, the activity increased in concentration dependent. At the highest concentration of 1,000 μg/mL, the DPPH and ABTS radical scavenging activity of the bee pollen showed 31.9% and 35.9%, respectively. The FRAP of the bee pollen showed 295.9 μM compared with control (88.7 μM). The total polyphenol and total flavonoid contents of the pollen showed 39.4 mg GAE/g and 2.1 mg QE/g. Based on these results, it is expected that Pinus densiflora pollen can be utilized widely as a natural antioxidant source in food and medical products.

Keywords:

Bee pollen, Pinus densiflora, Apis mellifera, Antioxidant activity

서 론

벌화분은 꽃가루가 응집된 덩어리로, 꿀벌이 꿀과 타액 물질로 만들어 벌집 입구에 보관하며 꿀벌의 단백질원이자 로열젤리 (royal jelly)를 생산하는 원료로 사용한다 (Lercker et al., 1981). 벌화분의 영양학적 주요 구성 요소는 탄수화물 13~55%, 조섬유 0.3~20%, 단백질 10~40%와 지질 1~10% 비율로 구성되어 있다. 그 외 미량 성분은 미네랄, 비타민, 페놀성 화합물, 플라보노이드, 스테롤 및 테르펜이 있다 (Feas et al., 2012). 이처럼 영양성분이 풍부하게 함유되어 있어 오래전부터 천연 건강식품으로 많이 섭취하거나 건강 기능 식품 원료로의 활용 방안 연구가 진행되고 있다 (Mejias and Montenegro, 2012). 벌화분은 천연 생리활성 물질로 이용 가치가 매우 높은 식품으로 항산화 (Yoon et al., 2005), 항균 (Kacaniova et al., 2012), 항당뇨 (Noh et al., 2018) 등 다양한 생리활성을 나타내고 있으며, 최근에는 전립선 비대증 및 전립선염 치료 (Shim, 2007) 등 다양한 질환에도 효과가 있는 것으로 나타났다. 그중 항산화 활성은 벌화분의 대표적인 기능성으로 알려져 있다. 항산화 활성은 인체 내 세포를 손상시켜 성인병, 암, 노화 등을 유발하는 활성산소 소거를 통해 식품이나 인체 내의 산화작용을 감소시키는 역할을 한다 (Cha and Lee, 2004). 특히, 벌화분의 중요한 항산화 활성 물질은 페놀성 화합물로, 벌화분에서 생리활성을 나타내는 식물 유래 2차 대사산물이며 벌화분의 색상과 특유의 쓴맛을 내는 역할을 한다 (Zuluaga et al., 2016). 다양한 종류의 벌화분의 항산화 활성 특성에도 불구하고 최근까지 보고된 연구에서는 소나무의 꽃으로부터 서양종꿀벌이 채집한 화분에 대한 항산화 활성 평가 연구는 보고된 바가 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 서양종꿀벌이 소나무로부터 채집한 소나무 화분의 에탄올 추출물을 제조하여 항산화 활성을 평가한 결과를 보고하고자 한다.

재료 및 방법

1. 실험재료

오프라인 시장에서 유통되고 있는 도토리 화분을 구매한 다음 연노랑의 색상을 나타내는 화분을 분류하여 -20℃에서 냉동 보관하면서 분석에 이용하였다. 모든 시약은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)에서 시약급 이상의 제품을 구매하여 분석에 사용하였다.

2. 분석시료 추출

화분 추출물은 시료 3 g에 대해 10배의 70% 에탄올을 가한 후 sonicator (Branson 8510, Emerson Electric Co., Ltd., USA)를 이용하여 1시간 추출한 후 추출액을 여과지 (filter paper No. 2, Whatman, UK)로 여과하는 과정을 3회 반복하였다. 추출물은 감압 농축기 (eyela Rotary evaporator N-1200, Tokyo Rikakikai Co., Ltd. Japan)를 이용하여 conical tube에 농축하였으며, 최종 시료 수득량은 1.1343 g으로 분석에 사용하였다.

3. 벌화분의 형태 관찰

화분의 외관은 현미경 (evos XL Core microscope, Thermo Fisher Scientific, MA, USA, ×200)으로 확인하였으며, 화분의 형태는 주사전자현미경 (emission-scanning electron microscope, SEM, S-2460N, Hitachi, Japan)로 관찰하였다

4. 항산화 활성 측정

화분 추출물의 항산화 활성도를 측정하고자 추출물을 농도별로 희석하여 시료로 사용하였고, DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 라디칼 소거 활성과 ABTS [2,2-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)] 라디칼 소거 활성으로 평가하였다. DPPH 라디칼에 대한 소거 활성은 Blois의 방법 (Hong et al., 2016)을 변형하여 측정하였다. 각 시료 20 μL에 0.02 mM DPPH 180 μL를 넣고 voltex한 후, 30분 동안 방치한 다음 spectrometer (spectramax M2 microplate reader, Molecular Devices, San Jose, CA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능은 시료 무처리구를 대조군으로 하여 이에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다.

DPPHradical scavenging activity%=1-Abs sampleAbs control×100

ABTS 라디칼 소거능은 Park et al. (2015)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 1 : 1 비율로 혼합한 후 냉암소에서 라디칼이 형성되는 24시간 동안 방치하였다. 제조한 ABTS 용액을 실험 직전에 spectrometer를 이용하여 732 nm 파장에서 흡광도 0.700이 되도록 에탄올을 이용하여 희석하여 사용하였다. 농도별 추출물 100 μL에 ABTS 용액 900 μL를 첨가하여 암소에서 10분간 반응시킨 후 732 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 다음의 계산식에 의하여 ABTS 라디칼 소거능 (%)을 산출하였다.

ABTSradical scavenging activity%=1-Abs sampleAbs control×100

5. FRAP (Ferric reducing antioxidant power) 활성 측정

FRAP assay 방법은 FRAPTM colorimetric detection kit (Arbor Assays, MI, USA)를 사용하여 실험하였다. 실험 방법은 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 분석하였고, Spectrometer를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였고, FRAP 활성도는 Fe (II) 표준곡선에 대한 선형 방정식을 기반으로 평가하였다. 시료 간의 활성을 비교하기 위해 대조군으로 ascorbic acid를 선정하여 같은 방법으로 측정하였다.

6. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

총 폴리페놀 함량은 Kim et al. (2020) 방법을 이용하여 실험하였다. 시료 100 μL에 Folin-Ciocalteu reagent 50 μL를 첨가하고 증류수 750 μL를 넣어 잘 섞어준 다음 5분간 실온에서 방치한 후 10% Na2CO3 1 mL를 가하여 725 nm에서 1시간 이내에 흡광도를 측정하였다. 표준검량선은 gallic acid에 대해 작성하였고, 이로부터 시료의 총 폴리페놀 함량을 산출하여 mg GAE/g으로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량은 염화알루미늄법 (Kim et al., 2005)에 따라 측정하였다. 농도별로 제조한 표준물질 quercetin과 시료를 각 0.5 mL에 95% 에탄올 1.5 mL, 10% AlCl3 용액 0.1 mL, 1 M C2H3KO2 용액 0.1 mL와 증류수 2.8 mL를 가하여 충분히 교반한 다음 30분간 방치한 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 AlCl3 용액 대신 증류수를 가한 것으로 상기 실험과 동일하게 조작한 다음 시료의 흡광도로부터 대조군 흡광도를 뺀 흡광도 차를 이용하여 작성한 표준검량선에 적용하여 총 플라보노이드 함량을 산출하였다.

7. 통계처리

본 실험의 결과는 3회 반복 측정을 통해 도출한 결과를 평균±표준편차로 나타내었으며, 통계 분석은 SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 ANOVA를 실시하였으며, Duncan’s multiple range test로 시료 간의 유의성이 있는 경우 차이를 검정하였다 (p<0.05).

결과 및 고찰

1. 벌화분의 동정

서양종꿀벌이 수집한 소나무 화분의 형태적 특성은 Fig. 1에서 나타내었다. 본 연구에서 경단처럼 알갱이 형태로 뭉쳐진 상태의 소나문 화분을 수집하여 시료로 사용하였다 (Fig. 1A). 소나무 화분을 광학현미경 (Fig. 1B)과 주사전자현미경 확인한 결과 (Fig. 1C), 작은 타원구형으로 형성되어 있으며 양쪽에 타원형의 그물 무늬 날개가 붙어 있어 쉽게 바람에 의해 날려서 흩어지는 구조로 확인되었다 (Pyo et al., 2020). 또한 화분의 표면은 매끄럽지 않고 그물 모양 무늬로 이루어져 있으며 발아공은 움푹 들어간 형태이고, 화분립은 과립상 형태의 무늬로 매끄럽다 (Kim et al., 2020). 이를 통해 바람에 의해 꽃가루가 전파되는 대표적인 풍매화분인 송화분의 전형적인 구조로 판단된다.

Fig. 1.

Morphology of the bee pollen collected by Apis mellifera.

2. 항산화 활성 평가

소나무 화분 농도별 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 활성 평가 결과는 Fig. 2와 같다. DPPH 라디칼 소거능 활성 평가는 라디칼을 포함하고 있는 DPPH 시약이 시료의 항산화 물질에 의해 활성 산소가 제거되면서 변색함을 통해 활성 산소가 제거되는 정도를 측정하는 천연 항산화제에 대해 간단하고 정확성이 높은 분석법으로 널리 사용되고 있다 (Kim, 2016). DPPH 라디칼 소거능 평가에서는 농도 의존적으로 항산화 활성도가 증가하였으며 가장 높은 농도인 1,000 μg/mL에서 31.9%로 높은 활성도를 보였다. 이는 기존 보고 (Pyo et al., 2020)의 송화분 활성도 결과 (15.0%)보다 우수한 활성도를 나타내었다.

Fig. 2.

DPPH radical scavenging activities of the bee pollen. Error bars represent the standard deviation of the mean and different letters indicate significant difference (p<0.05).

ABTS 라디칼 소거 활성 평가에서도 유사한 활성 패턴을 나타내었다 (Fig. 3). 측정 결과, 가장 높은 농도에서 35.9%로 우수한 활성도를 보였다. 본 연구에서는 시료의 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능을 확인하고자 Ascorbic acid를 positive control로 사용하였고, 시료의 농도가 높아질수록 DPPH 라디칼 소거능보다 ABTS 라디칼 소거능이 높게 나타났다. 이는 소나무 화분에 포함된 친수성을 나타내는 물질이 더 영향을 주어 상대적으로 ABTS 라디칼 소거능이 높게 나타난 것으로 사료된다 (Kim et al., 2016).

Fig. 3.

ABTS radical scavenging activities of the bee pollen. Error bars represent the standard deviation of the mean and different letters indicate significant difference (p<0.05).

Ferric reducing ability of plasma (FRAP) 분석법은 Fe (III) 이온이 항산화 물질에 의해 Fe (II) 이온으로 환원되는 정도를 평가하여 시료 내의 항산화 활성도를 측정하는 분석법이다 (Bang et al., 2019). FRAP에서도 상기 실험 결과와 비슷한 활성 경향을 보이며 295.8 μM으로 나타났다 (Fig. 4). 그러나 동일한 농도 (1,000 μg/mL)의 대조구인 ascorbic acid의 FRAP 활성도 (696.8 μM)와 비교하여 평가할 경우 낮은 환원력을 보였지만, 시료 무처리 대조군 (control, 88.7 μM)보다는 높은 환원력을 보였다 (p<0.05). 또한 시료의 농도가 높아질수록 FRAP 활성은 높아졌지만, 시료의 농도 간의 차이만큼 활성도의 차이는 크게 나타나지 않았다.

Fig. 4.

FRAP of the bee pollen. Error bars represent the standard deviation of the mean and different letters indicate significant difference (p<0.05).

3. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

소나무 화분을 에탄올로 추출하여 분석한 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 결과는 Table 1에 나타내었다. 페놀성 화합물은 식물계에 분포되어 있는 2차 대사산물로서 phenolic hydroxyl (OH)기를 가지고 있어 항산화 등 다양한 생리활성기능을 가진다 (Jo and Jung, 2006). 총 폴리페놀 함량 (TPC)은 39.4 mg GAE/g으로 나타났으며, 총 플라보노이드 함량 (TFC)는 2.1 mg QE/g으로, TPC 결과와 비교하였을 때 상당히 낮은 함량을 보였다. 이는 소나무 화분의 총 폴리페놀 중 플라보노이드 성분을 적게 함유한 것으로 보이며, 소나무 화분의 주요 페놀성 화합물은 플라보노이드 성분보다 gallic acid, tannic acid 등의 페놀산 화합물이 주를 이루고 있는 것으로 사료된다 (Hong et al., 2012).

Total polyphenol and total flavonoid contents of the pollen

적 요

서양종꿀벌이 소나무로부터 채집한 소나무 화분의 에탄올 추출물을 제조하여 항산화 활성을 평가하고자 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능 활성도, FRAP 활성 평가, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 분석하였다. 소나무 화분의 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 항산화 활성도를 평가한 결과, 처리 농도 중 가장 높은 농도인 1,000 μg/mL에서 DPPH (31.9%) 및 ABTS (35.9%)와 FRAP (295.8 μM)로 가장 높게 나타났다. 소나무 화분의 총 폴리페놀 함량은 39.4 mg GAE/g으로 우수한 함량에 반해 총 플라보노이드는 2.1 mg QE/g 낮은 함량을 보였다. 이를 통해 소나무 화분의 페놀성 화합물은 페놀산 계열의 성분들이 대부분 구성하고 있는 것으로 보인다. 따라서 본 연구 결과를 통해 소나무 화분이 우수한 항산화 활성을 보유한 천연물질로 확인되었으며, 분석데이터는 소나무 화분을 건강 기능성 식품 소재로 활용하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것이라 사료된다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원의 농업기초기반연구 (과제번호: PJ01512903)에 의하여 수행되었으므로 감사를 드립니다.

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Fig. 1.

Fig. 1.
Morphology of the bee pollen collected by Apis mellifera.

Fig. 2.

Fig. 2.
DPPH radical scavenging activities of the bee pollen. Error bars represent the standard deviation of the mean and different letters indicate significant difference (p<0.05).

Fig. 3.

Fig. 3.
ABTS radical scavenging activities of the bee pollen. Error bars represent the standard deviation of the mean and different letters indicate significant difference (p<0.05).

Fig. 4.

Fig. 4.
FRAP of the bee pollen. Error bars represent the standard deviation of the mean and different letters indicate significant difference (p<0.05).

Table 1.

Total polyphenol and total flavonoid contents of the pollen

Sample Total polyphenol contents1) (mg GAE/g) Total flavonoid contents2) (mg QE/g)
1)Total polyphenol contents were determinted by the Folin-Ciocalteau method (GAE: gallic acid equivalents)
2)Total flavonoid contents were determened by AlCl3 coloration (QE: quercetin equivalent)
3)Bee pollen: Pinus densiflora pollen collected by Apis mellifera
4)Each value is the mean±standard deviation.
Bee pollen3) 39.4±0.24) 2.1±0.9