Detection and Comparison of Nosema (Nosema spp.) in Apis mellifera and Apis cerana

서 론

미포자충(Microsporidia)은 세포내에서 증식하여 궁극적으로 마비를 일으키는 병을 일으키는 것으로써 곤충을 비롯한 무척추동물에 많이 알려져 있다(Larsson, 1986). 이러한 미포자충(Microsporidia)은 서양종 꿀벌(Apis mellifera)에서도 문제를 일으키는 질병을 야기하는데, 서양종 꿀벌(A. mellifera)에서는 Nosema병을 일으키는 미포자충(Microsporidia)과각종 질병 및 해충에 대하여서는 매우 많이 알려져 있다.Nosema의 세포 내 생활 형태에 대한 연구도 진행되어(Faith H et al., 1969) Nosema가 일으키는 세포독성은 이미 알려져 있다. 이러한 꿀벌에 피해를 주는 병원체인 Nosema는 꿀벌바이러스 등과 같은 각종 질병 원인체 및 해충과 연관성을 보이면서 꿀벌봉군붕괴현상의 주요한 요인으로 추측되어 관련한 연구가 활발하게 이루어졌는데(Diana L. Cox-Foster et al., 2007), 좀 더 심도 있는 질병과 꿀벌봉군감소간의 연관관계를 구명하기 위한 연구가 다양하게 진행되는 중 최근 꿀벌 봉군감소와 Nosema병의 연관성에 대한 연구결과가 보고되고 있다(Higes M et al., 2006, 2007). 이러한 Nosema병을 일으키는 병원체는 Nosema apis와 Nosema ceranae 두 종이 있는데, N. ceranae는 중국 북경의 동양종 꿀벌(A. cerana)에서 최초로 진단되어 알려졌으며(Fries et al., 1996), N. apis와 N. ceranae의 서양종 꿀벌(A. mellifera)과 동양종 꿀벌(A. cerana)에의 교차 감염에 대한보고도 있다(Fries 1997). 최근에는 N. ceranae와 꿀벌이 마비를 일으키는 바이러스와 동시에 발생했을 때 월동기 꿀벌의 감소에 미치는 연구결과로 꿀벌의 생리·생태적 환경과 연관해서 N. ceranae가 봉군의 감소 및 월동 봉군 폐사에 영향을 미친다는 보고도 있다(Ivan Toplak et al., 2013). N. ceranae는 N. apis와는 크기와 16s rDNA의 염기서열이 차이를 보이며, 크기는 N. apis가 N. ceranae에 비하여 크다(Ingemar Fries, 2010). 이러한 차이점을 이용하여 특이적인 primer를 제작하여 각각의 Nosema를 진단하거나 정량분석까지 가능한 기술이 개발되어 이용되고 있다(Brenna E. Traver et al., 2011, 2012; S Nabian et al., 2013). Nosema는 봉군 내에서 일벌의 먹이교환을 통하여 전염된다(Michael L. Smith, 2012). 따라서 거의 대부분의 꿀벌 질병이 비슷한 양상을 보이는 것과 같이 Nosema병도 발생초기에 방제 하지 못하면 전체 봉군으로의 확산이 매우 빠르게 된다. 현재 전세계적으로 가장 많이 쓰이고 있으며, 가장 효과적인 Nosema방제 약제로 알려져 있는 것으로 fumagillin이 있다. Fumagillin은 효과적인 Nosema 방제 약제이기는 하나 포유동물에 대한 독성을 가지고 있으며, 생산물에 대한 잔류의 위험성이 있는 물질이다. 이러한 fumagillin약제를 약 10배 및 100배 희석된 저농도로 사용했을 때에는 N. apis의 방제에는 효과적으로 작용을 하나 N. ceranae를 방제하는데는 효과적이지 못하며, 원액을 사용하였을 때 약제 방제 효과가 보고되고 있는데, 그 원인으로 fumagillin 저해효소를 N. ceranae가 분비함으로써 일어나는 현상이며(Wei-Fone Huang et al., 2013), 이 결과 N. ceranae를 방제하기 위하여 약제의 과다 사용으로 인한 생산물 오염을 경고하고 있다(Lowther WT et al., 2000; Lefkove B et al., 2007). 아울러 일벌과 여왕벌의 수명을 단축시키는 부작용도 보고되었다(Webster TC 1994; Rada V et al., 1997).

따라서 본 연구에서는 꿀벌의 봉군감소에 영향을 미치는 Nosema병의 연중 발생 양상을 관찰하여 양봉 농가의 Nosema 방제용 약제의 사용 시기를 결정하는데 도움을 주고 약제의 적절한 사용을 유도하여Nosema병 방제 약제의 생산물에 대한 잔류로 인한 생산물 품질 하락을 감소시키고 소비자의 건강을 위협하는 요인을 없애고 특히, N. ceranae의 발생에 따른 올바른 방제의 중요성을 확산하여 피해를 예방 할 수 있는기초자료로활용할목적으로연구를수행하였다.

재료 및 방법

Nosema 시료

Nosema 발생 양상을 확인하기 위하여 사용된 꿀벌은 서양종 꿀벌(A. mellifera)와 동양종 꿀벌(A. cerana) 두 종으로서 농촌진흥청 실험양봉장의 실험봉군에서 시료를 채취하였으며, 서양종 꿀벌(A. mellifera)에서 약제처리를 하지 않은 봉군의 Nosema 발생 양상을 조사하였다(Fig. 1). 이러한 Nosema 발생 정도를 국내 사육종인 서양종 꿀벌(A. mellifera)와 동양종 꿀벌(A. cerana) 두 종간 비교를 위하여 Fig. 1에서 구명된 Nosema 대증식기인 3∼5월동안 봉군별 Nosema 발생을 조사하였다.

Fig. 1.

Number of Nosema spores in Apis mellifera colonies per monthly.

결과 및 고찰

서양종 꿀벌(A. mellifera)에서의 연중 Nosema 포자발생 양상

서양종 꿀벌(A. mellifera)을 사육하는 양봉농가에서는 일반적으로 봄철에 Nosema병 예방 및 치료를 위한 각종 약제를 처리하고 있다. 본 연구에서 확인된 바와 같이 서양종 꿀벌(A. mellifera)에서 Nosema 포자의 발생 및 증감은 계절별 특성을 보이고 있는데, 월동기가 지나고 한 달 정도 경과 후 에 Nosema 포자수가 급격하게 증가하고 있으며, 약 두 달(4월) 정도 경과 후에Nosema 포자수가 최대치에 이른다. 또한 유밀기인 5∼7월경까지 급격하게 포자수가 감소하는 경향을 보이다가 무밀기인 8월∼9월경 약간의 포자 증가 추세를 확인 할 수 있다(Fig. 1). Nosema병은 일반적으로 탈분(화분 배설)을 하는 시기에 벌통근처 및 벌통에 묽은 형태의 탈분을 하는 것과 일벌들이 벌통 근처를 기어 다니는 형태의 병징을 보인다(Afonso C et al., 2012; Holly L Holt et al., 2013). 본 연구의 결과 이러한 증세를 보이는 시기는 일반적으로 Nosema 포자가 이미 최대치에 도달했을 때 양봉장에서 확인할 수 있는 병징으로 이시기에는 약제를 사용하여도 효율적인 Nosema병 방제가 어렵다. 따라서 연중 Nosema병을 적은 비용과 적은 약제의 사용으로 생산물에 대한 약제 잔류 등의 위험까지 줄일 수 있는 방법으로는 봉군이 월동 후 약 한 달 이내에 예방 차원의 Nosema 약제를 사용하는 것이 좋다는 것을 보여준다. 실제 Nosema 포자는 연중 증감을 반복하면서 방제약제를 사용하지 않아도 유밀기에는 포자수가 급격하게 감소하는 것을 확인 할 수 있는데, 이와 같은 현상을 보인다 하더라도 Nosema병의 방제는 필수적으로 수행 되어야 한다. 봄철 Nosema병이 발생한 봉군의 일벌은 외역을 하기 어렵고 봉세가 발달하는 속도가 그렇지 않은 봉군에 비하여 느려서 국내 양봉농가의 주 소득 원인아카시아벌꿀등을생산하는데지장을줄수있다.

연중 Nosema 포자가 가장 많이 증식하는 시기인 봄철(3~5월) Nosema 포자 수 조사 및 감염봉군 조사 결과, 조사 봉군 당 평균 45.8%의 감염율을 보였으며, 포자수는 서양종 꿀벌(A. mellifera) 일벌 한 마리 당 60~95만개의 포자가 관찰되었으며, 평균 73만개의 포자를 가지고 있는 것을 확인하였다. 또한, 동양종 꿀벌(A. cerana) 일벌에서는 평균 62%의 감영봉군 비율을 보이며, 개체 당 60만~350만개의 포자가 관찰되었으며, 평균 240만개의 포자가 관찰되어 서양종 꿀벌(A. mellifera)에 비하여 약 3배 이상의 포자수를 확인 할 수 있었다(Table 1, Fig. 2, Fig. 3). 이러한 결과에 따라서 국내 사육 중인 꿀벌 종인 서양종 꿀벌(A. mellifera)과 동양종 꿀벌(A. cerana)의 Nosema병 발생을 비교하여 보면, 동양종 꿀벌(A. cerana)의 Nosema병의 감염정도가 매우 심각함을 알 수 있다. 2009년 이후 국내 동양종 꿀벌(A. cerana)는 sacbrood virus에 의한 낭충봉아부패병 발생으로 약 90% 정도의 봉군이 폐사하는 상황이 발생하고 그 영향이 최근까지 지속적으로 반복되고 있다. 그러한 관점에서 볼 때 동양종 꿀벌(A. cerana)의 봉군 폐사를 촉진하고 낭충봉아부패병을 더욱 확산시키는 역할을 하는 것으로 Nosema도 중요한 역할을 하는 것으로 추측된다. 금후 동양종 꿀벌(A. cerana)에 대한 Nosema병 방제는 낭충봉아부패병 예방 및 관리 기술과 함께 중요한 방제 대상 질병일 것으로 보이며, Nosema 포자수의 감소를 통한 낭충봉아부패병발생도억제할수있을것으로기대된다.

Fig. 2.

Comparing of Nosema spores in colony seasonally (Spring) between Apis mellifera and Apis cerana. Mean spores per worker bee during spring season (March to May). Number of Nosema spores was counted by haemocytometer totally 30 worker bee per colony.

Fig. 3.

Comparing of infection rate of Nosema in colony seasonally (Spring) between Apis mellifera and Apis cerana. Number of Nosema spores was counted by haemocytometer totally 30 worker bee per colony.

Table 1.

Comparison of Nosema spores in Apis mellifera colonies during spring season (March~May)

일반적으로 Nosema병을 진단하기 위해서는 일벌의 중장을 분리하여 유발에 멸균수와 함께 마쇄 후 haemocytometer를 이용하여 포자 수 측정을 하면서 진단을 하게 되는데, 이는 N. apis와 N. cerana를 구분해서 진단하는 것이 매우 어렵다. 따라서 본 연구에서는 N. apis와 N. cerana를 특이적으로 진단할 수 있는 primer를 제작하여 PCR을 통한 Nosema 진단법을 개발하였다. Gene specific primer를 이용한 PCR에서 N. apis와 N. cerana 두 종을 동시에 진단할 수 있는 primer와 N. apis와 N. cerana를 각각 특이적으로 진단 할 수 있는 primer로 PCR한 결과 본 연구에 사용된 시료에서 N. apis는 진단되지 않았으며, 전체 시료에서 N. cerana만 진단되었다(Fig. 4A). PCR 산물의 염기서열분석결과 primer 부분을 제외하고 210bp의 염기서열(Fig. 4B)을 NCBI BLAST 결과 N. cerana 16s rDNA의 염기서열과 100% 일치함을 확인하였다. 따라서 국내에는 N. apis에 비하여 N. cerana에 의한 Nosema병 발생이대부분이며, N. cerana의약제저항성및질병발생위험성 등에 대한 보고를 바탕으로 볼 때 국내 Nosema병발생에 따른 봉군감소 등의 피해가 예상된다.

Fig. 4.

PCR and DNA sequence analysis of Nosema spp. (A) PCR amplification of representative bee samples collected from 2013 to 2014 in the RDA. For x-axis, No. 1 indicates that DNA was amplified with generic primers, Nosema F/R; No. 2 indicates DNA was amplified with specific primers, Nosema ceranae F/R; and No. 3 indicates DNA was amplified with specific primers, N. apis F/R, respectively. The primer pairs, Nosema F/R, N. apis F/R, and N. ceranae F/R generated PCR fragments of 208, 250, and 269 bp, respectively. (B) Sequence of N. ceranae. DNA that was extracted from bees collected from apiary in RDA.

Table 2.

Gene specific primer set for detection of 16s rDNA in Nosema spp.

적 요

최근 꿀벌의 봉군감소로 인한 꿀벌봉군붕괴현상인 Colony Collapse Disorder (CCD)를 야기하는 여러 가지 원인 중 하나로 Nosema병이 많은 관심을 보이고 있는데, 꿀벌에 Nosema병을 유발하는 원인체로는 Nosema apis와 Nosema ceranae 두 종이 있다. 특히 Nosema cerana는 동양종 꿀벌(Apis cerana)에서 최초 보고된 이후 서양종 꿀벌(Apis mellifera)에 확산되어 상호간교차 감염이 일어나고 있는 추세인데, Nosema cerana는 Nosema apis에 비하여 약제에 의한 방제효율도 낮으며, 이로 인한 봉군감소를 일으키고 있으며, 추후 더 많은 봉군감소에 영향을 미칠 가능성이 매우 높다. 따라서 본 연구에서는 국내 연중 Nosema의 발생 양상을 연구한 결과 봄철(3~5월)에 Nosema 포자가 가장 많이 증식하는 것을 확인하였으며, 농진청 실험양봉장에서의 시험결과 전체 시험봉군에서 Nosema cerana만이 검출되었다. 또한, 서양종 꿀벌(A. mellifera)에 비하여 동양종 꿀벌(A. cerana)에서 더 많은 Nosema 포자수가 관찰되었다. 최근 낭충봉아부패병 바이러스로 인한 봉군의 폐사가 지속적으로 반복되고 있는 동양종 꿀벌(A. cerana)에 Nosema병이 만연하고 있어서 낭충봉아부패병 바이러스의 발현에도 영향을 주어 더 빠른 속도로 동양종 꿀벌(A. cerana)의 감소가 발생하고 있음을 알 수 있다. 따라서 본연구의 결과를 바탕으로 양봉농가에서는 Nosema병의 조기방제를 통한 봉군감소 등의 피해를 줄이고 Nosema방제 약제의 부적절한 시기 및 과량사용으로 인한 양봉산물의 오염을 예방하는데 기초자료로 사용할 수 있을 것이다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 기관고유과제(No.PJ008601)의 연구비지원을 받아 도출된 성과입니다.

References

• Amao, M.B., Cano, A., and Acosta, M., (2001), The hydrophilic, Afonso, C., Paixao, VB., Costa, RM., (2012), Chronic toxoplasma infection modifies the structure and the risk of host behavior, PLoS One, (2012), 7(3), pe32489.
• Brenna, E. Traver, Richard, D. Fell., (2011), Prevalence and infection intensity of Nosema in honey bee (Apis mellifera L.) colonies in Virginia, J. Invertebr. Pathol, 107, p43-49.
• Brenna, E. Traver, Matthew, R. Williams,, Richard, D. Fell, (2012), Comparison of within hive sampling and seasonal activity of Nosema ceranae in honey bee colonies, Journal of Invertebrate Pathology, 109, p187-193.
• Diana, L. Cox-Foster, Sean, Conlan, Edward C. Holmes, Gustavo, Palacios, Jay D. Evans, Nancy A. Moran, Phenix-Lan, Quan, Thomas, Briese, Mady, Hornig, David M. Geiser, Vince, Martinson, Dennis vanEngelsdorp, Abby L. Kalkstein, Andrew, Drysdale, Jeffrey Hui, Junhui Zhai, Liwang Cui, Stephen K. Hutchison, Jan Fredrik Simons, Michael Egholm, Jeffery S. Pettis, W Ian Lipkin, (2007), A Metagenomic Survey of Microbes in Honey Bee Colony Collapse Disorder, Science, 318, p283-287.
• Faith H. Gray, Ann, Cali, John D. Brigcs, (1969), Intracellular Stages in the Life Cycle of the Microsporidian Nosema apis, J. Invertebr. Pathol, 14, p391-394.
• Fries, I., (1997), Protozoa, In: Morse, R.A., Flottum, K. (Eds.), Honey Bee Pests, Predators and Diseases, A.I. Root Company, Medina.
• Higes, M., Martin, R., Meana, A., (2006), Nosema ceranae, a newmicrosporidian parasite in honey bees in Europe, J. Invertebr. Pathol, 92, p93-95.
• Higes, M., Garcia-Palencia, P., Martin-Hernandez, R., Meana, A., (2007), Experimental infection of Apis mellifera honey bees with Nosema ceranae (Microsporidia), J. Invertebr. Pathol, 94, p211-217.
• Holly, L. Holt, Katherine, A. Aronstein, Christina, M. Grozinger, (2013), Chronic parasitization by Nosema microsporidia causes global expression changes in core nutritional, metabolic and behavioral pathways in honey bee workers (Apis mellifera), BMC Genomics 2013, 14, p799.
• Ingemar, Fries, (2010), Nosema ceranae in European honey bees (Apis mellifera), Journal of Invertebrate Pathology, 103, pS73-S79.
• Ivan, Toplak, Ursska, Jamnikar Cigleneccki, Katherine, Aronstein, Aless, Gregorc, (2013), Chronic Bee Paralysis Virus and Nosema ceranae Experimental Co-Infection of Winter Honey Bee Workers (Apis mellifera L.), Viruses, 5, p2282-2297.
• Larsson, R., (1986), Ultrastructure, function, and classification of Microsporidia, Prog. Protistol, 1, p325-390.
• Lefkove, B., Govindarajan, B., Arbiser, JL., (2007), Fumagillin: an anti-infective as a parent molecule for novel angiogenesis inhibitors, Expert Rev Anti Infect Ther, 5, p573-579. [https://doi.org/10.1586/14787210.5.4.573]
• Lowther, WT,, Matthews, BW., (2000), Structure and function of the methionine aminopeptidases, Biochim Biophys Acta, 1477, p157-167. [https://doi.org/10.1016/S0167-4838(99)00271-X]
• Michael, L. Smith, August), (2012, Honey Bee Parasite Nosema ceranae: Transmissible via Food Exchange?, PLOS ONE, www.plosone.org, 7(8).
• Rada, V., Machova, M., Huk, J., Marounek, M., Duskova, D., (1997), Microflora in the honeybee digestive tract: counts, characteristics and sensitivity to veterinary drugs, Apidologie, 28, p357-365. [https://doi.org/10.1051/apido:19970603]
• Webster, TC., (1994), Fumagillin Affects Nosema-Apis and Honey-Bees (Hymonopterai-Apidae), J. Econ. Entomol, 87, p601-604. [https://doi.org/10.1093/jee/87.3.601]
• Wei-Fone Huang, Leellen F. Solter, Peter M. Yau, Brian S. Imai, (2013), Nosema ceranae Escapes Fumagillin Control in Honey Bees, PLOS Pathogens, www.plospathogens.org, 7(8).