수벌번데기 지방추출물 처리에 따른 HaCaT 세포주에서 사이토카인 변화 분석도

서 론

Apis mellifera L strain에서 생산한 수벌번데기는 2022년 한시적 식품원료에서 식품원료로 허가됨에 따라 다양한 식품 제형으로 사용할 수 있게 되었다. 식용 곤충은 단백질 함량이 높아 기존 단백질 공급원의 대체제로 주목 받으며 전 세계적으로 응용 연구가 확대되고 있다. 그러나 우리나라뿐 아나라 세계 여러 나라 많은 사람들은 아직 곤충을 식용한다는 것에 거부감을 보이고 있어 이를 줄이기 위한 가공방법 개발, 곤충의 사육환경, 가공공정에 필요한 안전기준 제정 및 개정 등의 노력을 통해 식용곤충 시장의 안정적인 확산을 도모하고 있다. 이러한 세계적인 추세에 따라 우리나라 수벌번데기의 경우도 생산과정 단계부터 필요한 체계적인 안전 기준을 세우기 위한 노력을 하고 있으며 보관 및 다양한 식품 적용에 용이한 동결건조 분말 형태로 가공하고 있다. 이렇게 가공된 국내산 수벌번데기는 약 52%의 조단백, 15.9% 탄수화물, 26.2%의 조지방, 그 외 미량원소 및 비타민 등이 존재하는 우수한 식품원료로 평가되고 있다 (Kim et al., 2018). 수벌번데기에서 단백질 다음으로 많은 함량을 갖는 성분은 지방이다. 지방은 지방산 3분자에 글리세롤 한분자로 구성되어 있으며 지방산의 구조적 차이에 따라 불포화지방산과 포화지방산으로 나눈다. 지방산이 염증반응 억제 및 혈중 콜레스테롤 수치를 낮춰 심혈관계 질환 예방 효과에 대한 보고와 지방산의 항균 작용에 대한 연구 (Pereira et al., 2014)를 통해 지방의 기능에 대해 관심이 커지고 있다. 또한 지방은 지용성 비타민, 호르몬 등 우리의 대사에 중요한 물질들이다 (Desbois and Smith, 2010; Parsons et al., 2012; Casillas-Vargas et al., 2021).

염증은 유해한 자극에 대한 생체반응 중 하나로 면역세포, 혈관, 염증 매개체들에 의해 시작된다. 또한 염증은 선천 면역에 의해 매개되는 비특이적 반응으로, 목적은 세포의 손상을 초기 단계에서 억제하고, 상처 부분의 파괴된 조직 및 괴사된 세포를 제거하며, 동시에 조직을 재생하는 과정이다. 염증반응을 일으키는 물질로는 병원체, 손상된 세포, lipopolysaccharide (LPS)나 palmitate 같은 자극 물질, 위험신호 등이 있으며 (Tsutsumi-Ishii et al., 2003; Yamadera et al., 2018; Zhao et al., 2018; Ubanako et al., 2019; Choi et al., 2021; Park et al., 2021) 이들은 monocyte-macrophage 계통의 세포들을 활성화하여 pro-inflammatory gene 발현을 유도하며 anti-inflammatory gene 발현을 억제하게 하기도 한다 (Viola et al., 2019). Cytokine은 감염, 면역반응, 염증 등과 같은 반응의 조절자로 면역세포에서 분비되는 polypeptide이다 (Wang et al., 1995; Zhang and An, 2007; Ubanako et al., 2019). 이들은 여러 질병과 관련되어 최근에는 바이러스 및 다양한 질병의 치료제 후보 물질로서 관심을 받고 있다 (Bezold et al., 2019; Buckley et al., 2020; Kim et al., 2021; Olbei et al., 2021). 피부는 가장 넓은 부위를 차지하는 신체 조직으로 병원체 등 다양한 유해한 물질로부터 우리 몸을 보호하는 1차 방어막으로 면역학적 측면에서 매우 중요한 역할을 갖는다. 최근 들어 아토피성 피부염, 건선 등의 피부질환으로 많은 사람들이 고통 받고 있다. 이와 같은 피부질환의 명확한 원인은 알 수 없으나 병성기전 연구를 통해 면역반응 이상을 그 원인의 하나로 보고 있다. 근래 면역반응이상을 보이는 질환들에서 사이토카인, 케모카인 등을 이용한 치료법 개발연구가 계속되고 있다 (Sroka-Tomaszewska and Trzeciak, 2021). 꾸준한 관리를 필요로 하는 염증성 피부 질환은 감마 리놀렌산 같은 항염증 효과가 있는 지방산이 보조제로 사용되기도 한다.

이에 수벌번데기 지방추출물이 함유한 다양한 지방산이 피부보호관련 생리활성에 미치는 영향을 알아보고자 사람 유래 피부각질세포주, HaCaT 세포에 IFNγ을 처리하여 인위적으로 피부 염증 반응을 유도하였을 시 변화되는 사이토카인, 케모카인과 같은 세포 신호 물질의 종류와 발현 변화를 알아 봄으로써 수벌번데기의 식용으로서의 활용뿐 아니라 산업적으로 활용 가능성에 대해 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

1. 수벌번데기 지방추출

2022년 완주양봉농가에서 구입하여 채취한 수벌번데기는 -70°C 냉동고에 보관하여 실험에 사용하였다. 수벌번데기 700 g을 500 mL의 3차 증류수를 넣고 분쇄 후 300 μm 체에 걸러 추출액을 제조하였다. 수벌번데기 추출액은 sonication 후 4°C에서 원심분리 (15000 rpm, 30 min)하여 지방층을 수집하였다. 수집한 지방층을 40°C 항온조에서 1시간 정치시킨 후 40°C에서 2차 원심분리 (15000 rpm, 30 min)하여 상층의 노란 빛을 띠는 지방추출물을 수집하였고 이를 -20°C에 보관하여 사용하였다 (Fig. 1).

Fig. 1.

Fat extract of drone pupa (Apis mellifera L.).

결 과

1. 수벌번데기 지방추출물의 cell viability

물을 용매로 하여 추출한 수벌번데기 지방의 생리활성을 알아보기 위해 1×10⁴ cell/well의 HaCaT 세포에 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125, 0.390625, 0.1953125, 0.09765625 μg/mL의 농도로 수벌번데기 지방추출물을 처리하여 96시간까지 반응시켰다. 이 때 지방추출물은 FBS 대신 0.25% BSA (bovine serum albumin, fatty acid free)를 넣은 DMEM 배지를 사용하였다. 대조군과 비교한 지방추출물 처리군의 생존률은 반응시간이 지남에 따라 6.25, 3.125 μg/mL 농도에서 생존율은 증가하는 경향을 보였고, 0.78125 μg/mL 이하의 농도에서는 96시간에서 생존율의 감소를 나타내었다 (Fig. 2).

Fig. 2.

Viability of HaCaT cells in fat extract of drone pupa. HaCaT cells were seeded on 96 well plates at a density of 1×104/well. After sixteen hours, the fat extract of drone pupa was treated for 24, 48, 72, 96 hrs. And then the Ez-cyto reagent was added, incubated for 3 hrs, and the OD value was measured at 450 nm. The values are expressed as the mean±STD (n=3). T-test was used to calculated statistical significance. *p≤0.05; **p≤0.01; ***p≤0.0001.

2. 수벌번데기 지방추출물에서 지방산분석

수벌번데기 지방추출물에 존재하는 지방산의 종류와 분포를 알아보기 위하여 지방산분석을 한 결과 21개의 지방산이 검출되었으며 이들은 11개의 포화지방산과 10개의 불포화지방산으로 구성되어 있으며 포화지방산과 불포화지방산의 비율은 불포화지방산 44%, 포화지방산 56%로 나타났다. 검출된 지방산은 palmitic acid와 oleic acid가 각각 42%와 41%로 높은 비율을 차지하고 있으며 다음으로 stearic acid (11%), myristic acid (3%), palmitoleic acid (1%), linoleic acid (1%), cis-11-Eicoecoic acid (1%) 순으로 나타났다 (Fig. 3, Table 1).

Fig. 3.

Composition of fatty acids in drone pupa fat extract.

Table 1.

Qualitative and Quantitative analysis of fatty acids in fat extract of drone pupa

3. 수벌번데기 지방추출물 처리에 따른 HaCaT 세포에서 사이토카인들의 변화

HaCaT 세포에 IFNγ로 염증반응을 유도하여 수벌번데기 지방추출물을 처리하였을 때 사이토카인, 케모카인을 포함한 세포신호물질의 변화를 조사하기 위하여 HaCaT 세포 배양에 사용하였던 10% FBS DMEM 배지와 수벌번데기 지방추출물 처리에 사용한 0.25% BSA DMEM 배지를 대조군으로 하였다. 수벌번데기의 지방추출물 처리군의 단백질의 변화는 처리 시간, 처리 농도에 따라 변화를 보였다. 이때 검출된 단백질은 25종류이며 검출된 단백질은 한쌍의 유전자로 구성되어 총 48개의 유전자가 조사되었다. 수벌번데기 지방추출물을 처리한 실험군이 대조군보다 발현 증가된 단백질은 21개, 발현 감소한 단백질은 6개로 나타났다. 그리고 수벌번데기 지방추출물 실험군에서만 발현된 단백질은 21개로 나타났다 (Fig. 4). 수벌번데기 지방추출물의 처리로 변화를 보인 사이토카인, 케모카인의 기능은 조직개선, 혈관재생, 상처치유, 염증억제, 항균물질 생산활성, 세균성장억제, 면역반응조절에 관여하는 것으로 나타났다 (Table 2).

Fig. 4.

Effects of drone pupa (DP) fat treatment on interferon γ-induced cytokines. Human keratinocyte, HaCaT cells at densities of 2×104 cell/mL were pretreated with 10 ng/mL IFNγ for 24 hrs. After that, the HaCaT cells were treated with drone pupa extracted oil for 24, 48 hrs. Cytokine profile was determined via human cytokine assay kit (R&D systems). A, E, 0.25% BSA; B, F, 10% FBS; C, G, 6.25 μg/mL DP oil extract; D, H, 1.56 μg/mL DP oil extract.

Table 2.

Cytokines and Chemokines detected by drone pupa fat extract in HaCaT cells

고 찰

우리나라에서 수벌번데기는 다양한 식품에 응용될 수 있는 식품원료로 허가되었으며 고부가가치 식품소재로서의 가능성을 알아보고자 여러 생리활성에 대한 연구들이 진행되어 왔다. 그 결과 수벌번데기의 추출물이 염증 매개 사이토카인 억제, 항당뇨, ADH (alcohol dehydrogenase)활성, 암세포사멸 효능과 같은 생리활성이 있음을 알 수 있었다 (Kim et al., 2020; Kim et al., 2021; Kim et al., 2022). 식용 곤충의 영양성분은 단백질, 지방, 탄수화물을 모두 포함하고 있으며 단백질 함유량이 높다는 장점으로 미래의 단백질 대체제로서 주목하고 있다. 또한 이들은 지방의 함량도 높아 지방을 추출하여 지방의 생리활성에 대한 연구도 이뤄진 바 있다. 그 예로 갈색거저리에서 추출한 오일의 항암효과가 있다 (Wu et al., 2020). 높은 지방 함량은 식품원료로서 품질 관리적 측면, 생산적 측면에서 산패에 대한 문제와 제형의 어려움이 발생하기도 한다. 이를 해결하기 위한 연구도 진행되고 있다 (Son and Hwang, 2017; Kim et al., 2019). 식품원료 수벌번데기는 단백질을 구성하는 아미노산 중 글루탐산 함량이 높아 열을 가했을 때 감칠맛을 나타내는데 이러한 특성으로 인해 높은 단백질 함량을 갖지만 다양한 소재로 접근하는 데 제한이 있을 수 있다. 또한 지방산 연구를 통해 보고된 다양한 생리활성은 수벌번데기에 적용하기에 충분하였다. 이에 새로운 수벌번데기의 가공방법을 모색하고 이에 따른 생리활성을 알아보기 위해 지방을 추출하였다. 수벌번데기의 지방을 식품으로 적용하기 위해 용매를 물로 하여 지방을 추출하였으며 지방산을 분석한 결과 21개의 지방산이 존재하고 이들은 포화 지방산뿐 아니라 불포화지방산을 거의 50%씩 함유하고 있었다. 주요 불포화지방산은 41%를 차지하는 oleic acid이었고 그 외 linoleic acid, linolenic acid, cis-5, 8, 11, 14, 17-Eicosapentanoic acid가 각각 1% 순으로 분포하였다. 불포화지방산은 지방산 사슬 내에 한 개 이상의 이중결합을 갖는 지방산으로 염증반응 억제 및 혈중 콜레스테롤 수치를 낮춰 심혈관계 질환을 예방하는 효과가 보고된 바 있다 (Pereira et al., 2014). 이 외 지방산의 항균 작용에 대한 연구도 진행된 바 있다 (Desbois and Smith, 2010; Parsons et al., 2012; Casillas-Vargas et al., 2021). 반면 포화지방산의 분포는 42%의 palmitic acid, 11%의 stearic acid, 3%의 myristic acid, 1%의 palmitoleic acid 순이었다. 이와 같은 포화지방산도 심혈관계에 좋은 영향에 대한 연구가 보고되고 있으며 지용성 비타민, 호르몬 등 우리의 대사에 중요한 물질로 알려지고 있다. Palmitic acid, stearic acid, myristic acid와 같은 지방산은 식품뿐 아니라 화장품, 비누, 등과 같은 산업용 소재에 사용되는 유화제로 이미 사용되어오고 있다. Oleic acid, linoleic acid 등 여러 불포화지방산의 염증억제효과와 포화지방산인 stearic acid, myristic acid도 각각 LDL을 낮추거나 HDL을 높이는 효과가 있음이 보고된 바 있어 수벌번데기 지방추출물은 식품뿐 아나라 산업용으로 활용할 수 있을 것으로 생각되었다 (Kromhout et al., 1995; Hunter et al., 2009). 이에 수벌번데기 지방추출물이 산업용으로 활용할 수 있는지 알아보기 위해 사람 각질 세포주에 인위적으로 염증 유발시켜 사이토카인, 케모카인 등의 세포신호물질 105종에 대한 발현변화 유무를 통해 피부를 보호하는 생리활성을 알아보고자 하였다. 수벌번데기 지방추출물은 사람각질세포주, HaCaT에서 25종의 다양한 신호물질들을 유도하였다. 이들 신호전달물질들의 기능은 크게 세포, 혈관 및 골격 재생에 관여하는 물질, 상처치유, 염증관련, 항균물질 생산, 세균성장억제 관여 물질 및 암세포 전이에 관여하는 것으로 나타났다 (Jin et al., 2014; Kim et al., 2016; Albanesi et al., 2018; Ridiandries et al., 2018; Sun et al., 2018; Quintero-Fabian et al., 2019; Piipponen et al., 2020; Xu et al., 2021; Liu et al., 2022; Yang et al., 2022; Zhai et al., 2022) (Table 2). 최근 화장품에 의학적 효능을 더한 cosmeceutical이라는 분야가 피부보호 및 개선, 노화 억제, 염증성 피부질환 등의 연구를 통해 주목받고 있다 (Ahmad and Ahsan, 2020). 우리의 결과는 수벌번데기 지방추출물이 식품뿐만 아니라 cosmeceutical로서 응용될 수 있는 가능성을 볼 수 있었다. 현재 식용으로 사용하는 수벌번데기는 농가에서 식용을 목적으로 사육한 것으로 수벌전용 소초광에 산란한 알이 번데기가 되었을 때 냉동보관하고 밀랍 및 유충등을 제거한 후 순수 양질의 번데기만을 선별하여 사용하고 있다 (Kim et al., 2021). 이 선발 과정에서 제거되는 수벌번데기와 양봉농가에서 천연 응애제거제로 활용하는 수벌번데기의 지방을 산업적으로 이용할 수 있게 된다면 농가에게 경제적으로 도움이 될 것으로 생각된다. 앞으로 수벌번데기 지방추출물이 보이는 염증치료 및 예방에 대한 활성을 cosmeceutical 분야에 적용할 수 있는지 다양한 조건에서 효능을 검증할 후속 연구가 계속적으로 수반되어야 할 것이며 이를 기반으로 수벌번데기 지방추출물이 다양한 산업소재로 활용할 수 있기를 기대한다.

Acknowledgments

본 연구는 국립농업과학원 농업과학기반기술연구사업(과제번호: PJ01512902)에 의하여 수행되었습니다.

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