동충하초 폐배지 추출물을 이용한 Paenibacillus larvae 항균활성 검정

서 론

꿀벌은 벌꿀, 프로폴리스, 로얄젤리, 봉독, 화분, 밀랍 등 다양한 양봉산물을 생산하는 산업화된 산업곤충 중 하나이다. 최근 통계결과에 따르면 우리나라 2014년 벌꿀 생산액은 2천 4백억 원 수준으로(한국양봉협회, 2015), 축산업 생산액(18조원)의 1.3%의 비중을 차지하고 있으며, 약 2만 농가가 양봉업에 종사하고 있는 것으로 확인되고 있다. 그러나 최근 꿀벌은 전 세계적으로 질병(Bakonyi et al., 2002; Bailey, 1975; Bailey and Ball, 1991), 환경오염, 농약피해, 기후변화 등으로 인해 개체 수 감소가 가속화되고 있어(Watanabe, 2008; Ho and Cummins, 2007), 이에 대한 대책이 시급한 상황이다.

지금까지 알려져 있는 꿀벌의 주요 질병은 크게 감염성 질병과 기생성 질병으로 나눌 수 있다. 감염성 질병은 다시 세균성과 바이러스성, 진균성, 원생동물성 질병으로 나뉘는데, 그중 꿀벌 부저병은 세균성 질병으로, 그 원인균에 의해 다시 미국부저병(American foulbrood, AFB)과 유럽부저병(European foulbrood, EFB)으로 나뉜다. 미국부저병은 Paenibacillus larvae에 의해 꿀벌 유충에 병징을 일으키는 유충질병으로, White(1906)에 의해 처음 확인되었다. 이는 꿀벌에 발생하는 세균성 질병 중 가장 심각하고 위험한 것으로(Genersch et al., 2006), P. larva 포자가 함유되어있는 꿀, 화분 등의 먹이를 섭취함으로써 감염을 일으킨다. 미국부저병의 위험성은 P. larva로부터 생성되는 내생포자로부터 비롯된다. 이 병원체의 내생포자는 열등에 강한 내성을 지니고 있어 꿀이나 토양 등에 수년 내지 수 십년간 잔류 할 뿐만 아니라 높은 전염성을 지니고 있어 양봉장 전역에 빠르게 감염을 일으켜 큰 피해를 입게 되는 것을 특징으로 한다(Matheson and Reid, 1992).

미국부저병의 예방과 치료는 주로 옥시테트라사이클린(oxytetracycline hydrochloride, OTC) 이나 설파티아졸(sulfathiazole)과 같은 항생제 사용을 통해 이루어진다. 그러나 이러한 항생물질의 광범위한 사용은 벌꿀 및 기타 양봉산물 내 항생제 잔류 문제를 야기 시킬 뿐만 아니라, 항생제 내성균을 발생시켜(Kochansky et al., 2001; Piccini and Zunino, 2001) 유럽 대부분의 국가에서는 항생제 사용을 금지하고 있다. 이에 대한 대책으로 최근에는 AFB 저항성 꿀벌 계통의 육성(Wedenig et al., 2003), 길항 미생물(Evans and Armstrong, 2006) 및 천연항생물질 개발(Antunez et al., 2008; Fuselli et al., 2008) 등과 같이 AFB에 대한 항생제 사용을 억제하기 위한 다양한 연구개발이 이루어지고 있는 실정이다.

동충하초는 살아있는 곤충을 기주로 살아가는 곤충 기생균으로, 다양한 생리활성 물질을 함유하고 있다(Gu et al., 2007). 동충하초는 지금까지 약 800여 종이 분리·동정되어 왔으나 우리나라 식품공전 상 식품에 사용할 수 있는 원료로 분리되어 있는 것은 눈꽃 동충하초(Paecilomyces japonica / P. tenuipes)와 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris) 두 가지 뿐이다. 그 중 밀리타리스 동충하초는 간기능 개선, 항암, 항염증 등 다양한 임상에 효과가 있으며(김 등, 2012; 조 등, 2008; 최 등, 2012; Park et al., 2005; Kim et al., 2008; Han et al., 2010), 코디세핀(cordycepin), 다당류(polysaccharides), 에르고스테롤(ergosterol), 만니톨(mannitol) 등의 주요 성분을 포함 하고 있는 것으로 알려져 있다(Das et al., 2010). 특히 동충하초는 다양한 균주에 대한 높은 항균 활성을 지니고 있다. 최근 Reis 등(2013)에 의한 연구결과에 따르면 밀리타스 동충하초는 그람 음성균 및 양성균 모두에 대해 높은 항균활성을 지니고 있으며, Ahn 등(2000)은 밀리타리스 동충하초의 주요 성분인 코디세핀(cordycepin)이 그람 양성균인 Clostridium paraputrificum에 대해 강력한 항균효과가 있다고 밝힌 바가 있다. 그러나 동충하초는 이처럼 다양한 생리활성 특성을 보유하고 있음에도 불구하고, 고가라는 비용적 한계 때문에 천연물 약제로서의 광범위한 적용에는 어려움을 겪고 있다. 따라서본연구에서는 이러한 한계를 극복하고자 동충하초의 자실체 부분을 제외한 폐배지 부분을 꿀벌 질병 방제에 이용하고자 하였다.

재료 및 방법

동충하초 폐배지 추출물의 용매분획 및 TLC 분석

동충하초 폐배지 추출물(178.5g)의 H₂O 현탁액(3L, 동충하초 배지 분말 3.5kg wet wt. eq.)에 n-hexane(3L×3), chloroform(3L×3), ethyl acetate(3L×3), 수포화 BuOH(3L×3)를 순차적으로 용매 분획하였다(Fig. 1). 얻어진 각 획분들은 감압 농축한 후 무게를 측정한 다음 CHCl₃/EtOAc/AcOH/MeOH(9:1:0.1:0.1, v/v/v/v)와 BuOH/AcOH/H₂O=4:1:1(v/v/v) 전개용매를 이용해 TLC chromatography를 실시하였다(Silica gel 60 F254, 0.25mm thickness, Merck, Darmstadt, Germany). 전개된 TLC plate 발색은 cerium sulfate hydrate를 사용하였으며, 항산화 활성 물질의 존재 여부를 평가하기 위해 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) ethanol 용액(200μM)을 TLC plate에 분무하여 발색시켜 탈색되는지 여부를 확인하였다(Fig. 2, 3).

Fig. 1.

Extraction and solvent partitions from waste product of Cordyceps militaris.

결과 및 고찰

동충하초 폐배지 추출물에 의한 용매 분획

본 연구에서는 동충하초 폐배지 추출물(3.5kg)을 MeOH 추출하여 추출물 178.5g을 얻었으며, 이를 대상으로 용매분획을 행하여 n-hexane 층(49.3g), chloroform 층(15.55g) ethyl acetate 층(1.4g), 수포화 BuOH 층(7.77g) 및 H₂O 층(36.69g)을 각각 얻었다. 용매분획 후 얻어진 각 획분들은 TLC 분석을 통해(Fig. 2, 3) 각 획분에 함유되어 있는 화합물들의 존재경향을 비교·분석하였다. 이때 동충하초 자실체 추출물을 대조군으로 사용하였다. 그결과, 동충하초 자실체 추출물에서 확인된 spot 들이 동충하초 폐배지 추출물에서 확인된 spot 들과 매우 유사한 경향을 보여, 동충하초 자실체 추출물 및 동충하초 폐배지 추출물에는 서로 유사한 종류의 화합물을 함유하고 있을 것으로 확인된다. 또한 이들의 패턴은 n-hexane 층과도 매우 유사해 동충하초 폐배지 추출물에 함유되어있는 화합물이 n-hexane 층으로 많이 이행되었을 것으로 확인되었다. 그 결과는 cerium sulfate hydrate 발색(Fig. 2-C, 3-C)을 통해 추가로 확인했으며, 그 결과 동충하초 및 동충하초 폐배지 추출물에서 확인된 spot 들이 n-hexane 층과 매우 유사한 패턴으로 존재하는 것이 관찰되었다. spot의 색깔은 흑색과 황색 등 다양한 색이 혼재하고 있어 당류 및 아미노산을 비롯해 페놀성 화합물까지 다양하게 함유되어져 있을 것으로 확인되었다. 또한 DPPH ethanol 용액을 분무하여 항산화 활성화합물들의 존재 경향을 검토한 결과, 비극성 조건인 CHCl₃/EtOAc/AcOH/MeOH=9:1:0.1:0.1 (v/v/v/v) 전개 용매에 의해 전개된 화합물의 경우 n-hexane (1)층 및 동충하초 폐배지 추출물 (5)에서만 탈색된 spot이 관찰되는 반면 (Fig. 2-D), 극성조건인 BuOH/AcOH/H₂O=4:1:1 (v/v/v) 전개용매에 의해 전개된 화합물의 경우 대부분의 분획물에서 탈색된 spot이 고루 관찰되었다(Fig. 3-D). 이 결과를 통해 동충하초 폐배지 추출물 내 함유되어 있는 항산화 활성을 지닌 비극성 물질은 n-hexane 층으로 대부분 이행 되었으며, 항산화 활성을 지니는 극성 물질은 n-hexane 층을 비롯한 다른 층으로도 상당 부분 이행 된 것으로 확인 할 수 있었다.

Fig. 2.

Thin-layer chromatography (TLC) of C. militaris waste product solvent fraction. The TLC plate developed using a mixture CHCl3/EtOAc/AcOH/MeOH=9:1:0.1:0.1 (v/v/v/v) and visualized by UV, DPPH ethanol solution and 1% cerium (IV) sulfate ethanol solution spray.; A, 254nm UV; B, 365nm UV; C, cerium sulfate hydrate.; D, 200μM DPPH ethanol solution. ; 1. n-hexane layer, 2. chloroform layer, 3. ethyl acetate layer, 4. fruit body of C. militaris extract, 5. waste product of C. militaris extract, 6. water-saturated n-butanol, 7. water layer.

Fig. 3.

Thin-layer chromatography of C. militaris waste product solvent fraction. The TLC plate developed using a mixture BuOH/AcOH/H2O=4:1:1 (v/v/v) and visualized by UV, DPPH ethanol solution and 1% cerium (IV) sulfate ethanol solution spray.; A, 254nm UV; B, 365nm UV; C, cerium sulfate hydrate.; D, 200μMDPPH ethanol solution. ; 1. n-hexane layer, 2. chloroform layer, 3. ethyl acetate layer, 4. fruit body of C. militaris extract, 5. waste product of C. militaris extract, 6. water-saturated n-butanol, 7. water layer.

Radial diffusion assay에 의한 항균활성 검증

본 연구에서는 radial diffusion assay를 통해 Paenibacillus larvae에 대한 동충하초 폐배지 추출물 및 동충하초 폐배지 용매 분획별 항균활성 효과를 검증하였다(Table 1, Fig. 3). 이때 대조군으로는 현미 동충하초 자실체 추출물을 사용하였으며, 사용된 용매분획물은 현미 동충하초 폐배지 추출물 n-hexane 층 및 chloroform 층, ethyl acetate 층, 수포화 BuOH 층을 사용하였다. 동충하초 폐배지 추출물 및 각각의 분획물은 0mg/ml, 1mg/ml과 10mg/ml에 대한 생장억제구역(IDZ)의 크기를 조사 하였으며, 항균활성 정도는 생장억제구역 크기를 통해 나타내었다(Table 1). 실험에 의한 생장억제구역의 크기는 각각의 분획물 농도에 비례하여 증가하였다. 즉 분획물 0mg/ml 및 1mg/ml에비해 10mg/ml에 대한 생장억제구역 크기가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 분획물의 종류에 따라서는 ethyl acetate 분획물 10mg/ml에서 가장 높은 항균 활성능력이 확인 되었다. 특히 ethyl acetate 획분은 1mg/ml의 농도에서는 MeOH 추출물과 비슷한 5~10mm의 항균 활성을 보이지만, 10mg/ml의 농도 상에서는 15~20mm로 10~15mm의 항균 활성을 보이는 MeOH추출물과는 달리 높은 항균활성을 나타내는 것으로 확인 되었다. 또한 1mg/ml의 농도에서 전혀 항균활성을 나타내지 않았던 수포화 BuOH 획분은 10mg/ml의 농도에서 15~20mm의 높은 항균 활성을 나타내었다(Table 1, Fig. 3). 이 결과는 Reis 등(2013)에 의한 그람 음성균 및 양성균에 대한 항균활성 실험결과와 유사하다. 이들 연구결과에서는 그람 음성균 및 양성균에 대해 밀리타리스 동충하초가 높은 항균활성 효과가 있다고 밝혔는데, 특히 밀리타리스 동충하초 MeOH 추출물의 ethyl acetate 획분과 수포화 BuOH 획분에서만 특이적으로 항균활성을 보인다고 밝혔다.

Table 1.

Antimicrobial activities of C. militaris fruit body and C. militaris waste product solvent fraction against Paenibacillus larvae

지금까지 미국부저병 방제를 위한 천연항생물질의 개발은 주로 프로폴리스 및 다양한 식물의 에센스 오일을 이용한 항균활성 검증에 대한 보고가 이루어 졌다. 그 중 Antúnez(2008) 등은 1% 프로폴리스 에탄올 추출물에서 P. larvae 에 대해 20~30mm 정도의 항균활성을 보였으며, 이는 프로폴리스 내에 함유하고 있는 페놀 및 플라보노이드 성분에 의한 항균 작용일 것으로 여겨진다. Fuselli 등은(2008) 감귤류로부터 추출한 에센스 오일로부터 P. larvae에 대한 항균활성 효과를 검증한 바 있다. 이들에 따르면, 감귤 에센스의 P. larvae에 대한 항균활성은 감귤류가 함유하고 있는 테르펜의 수산화기로부터 기인하는 것이라고 밝혔다. Bilikova 등(2013)은 프로폴리스 ethyl acetate 층으로부터 극성의 신규화합물을 분리하여 부저병 균주에 대한 우수한 항균활성 효과를 확인 하였는데, 이 또한 페놀성 물질이 가지는 수산화기가 P. larvae에 대한 항균활성에 영향을 미치는 것으로 판단되었다. 이러한 결과 등을 종합하면 미국부저병 원인균인 P. larvae는 페놀성 물질 등이 함유하고 있는 수산화기에 의해 항균활성 효과를 보이는 것으로 확인된다. 본 연구결과에서는 동충하초 자실체 및 동충하초 폐배지 추출물의 P. larvae에 대한 항균활성 효과를 검증하였다. 특히 ethyl acetate 층에서 가장 강한 항균활성 효과가 있는 것으로 확인되었는데, 이는 동충하초 자실체 및 동충하초 폐배지 추출물이 함유하고 있는 물질 중 수산화 기를 함유하고 있는 극성 물질이 ethyl acetate 층으로 다량 전이 되어 나타난 결과로 여겨진다. 이는 추후 후속연구 등을 통해 단일 물질을 분리하고 기작을 밝힐 필요가 있을 것으로 사료된다.

본 연구에서는 동충하초 폐배지 추출물의 분획물로 부터 부저병 원인 균주인 P. larvae에 대한 항균활성을 검증 하였다. 이는 동충하초 및 동충하초 폐배지 추출물로부터 부저병 억제효과를 확인한 첫 번째 사례이다. 동충하초 폐배지는 동충하초를 접종하여 키운 배양배지로, 자원으로 활용이 되지는 않지만 cordycepin 등의 동충하초 생리활성 유효성분이 전이되어 동충하초 자실체와 유사한 생리활성 기능을 가지고 있는 것으로 확인된다. 그러나 동충하초 폐배지는 자실체에 비해 1/10 이상 낮은 가격으로 구매가 가능하여 저렴한 비용으로 양봉농가에서 천연물 약제로 활용이 가능할 것으로 여겨진다. 특히 저자는 앞선연구에서 동충하초 폐배지 추출물이 꿀벌 질병중 하나인 노제마 질병 방제에 효과가 있는 것을 확인하였다(김 등, 2015). 이는 동충하초 폐배지 추출물을 이용하여 꿀벌의 주요 질병인 미국부저병을 비롯하여 꿀벌 노제마병까지 동시 방제할 수 있는 가능성을 제시함으로써, 방제비용 및 노동력 절감 효과가 클 것으로 기대된다. 본 연구에서는 또한 동충하초 폐배지 추출물 용매 분획별 항균효과를 별도로 검증하였다. 이로써 동충하초 및 폐배지가 함유하고 있는 유효물질을 분리하는데 기초자료로 활용이 가능할 것으로 생각된다.

적 요

미국부저병(American foulbrood, AFB)은 Paenibacillus larvae에 의해 발생되는 세균성 질병으로, 내생 포자 생성으로 인해 방제가 어려워 꿀벌에 심각한 피해를 끼치는 꿀벌의 주요 질병 중 하나이다. 미국부저병의 방제는 주로 항생제에 의존하고 있으나, 현재 유럽의 대부분의 국가에서는 미국부저병 방제에 항생제 사용을 엄격히 금지하고 있는데다 최근 양봉산물 내항생물질의 잔류 및 내성균의 출현 등의 문제로 인해 이를 대체할 수 있는 천연방제제의 개발이 시급한 상황이다. 본 연구에서는 동충하초 배지 추출물을 이용한 꿀벌 부저병 천연물 방제를 위해 동충하초 배지 추출물을 용매 분획하여 TLC 크로마토그래피를 수행하였다. 먼저 3.5kg의 동충하초 배지 분말을 메탄올로 추출하여(178.5g) 이를 대상으로 용매분획을 행하여 n-hexane 층(49.3g), chloroform 층(15.55g) ethyl acetate 층(1.4g), 수포화 BuOH 층(7.77g) 및 H₂O 층(36.69g)을 각각 얻었다. 용매분획 후 얻어진 각 획분들은 TLC 분석을 실시하였으며, 이들 획분에 대한 P. larvae 항균활성을 검증하기 위한 radial diffusion assay를 수행하였다. 그 결과 수포화 BuOH 및 ethyl acetate 획분 10mg/ml의 농도에서의 생장억제구역(IDZ)의 크기는 15~20mm로 가장 높은 항균 활성 능력이 있는 것으로 확인되었다. 이는 동충하초 및 동충하초 폐배지 추출물로부터 부저병 억제효과를 확인한 첫 번째 사례이며 추후 동충하초 폐배지 추출물에 대한 유효물질 분리를 위한 기초자료로 제공될 수 있을 것으로 기대된다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 시험연구사업(PJ01120101)의 연구비로 수행된 결과이며 이에 깊은 감사를 드립니다.

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