국산 아카시아꿀 내 Abscisic acid의 UPLC 정량분석법 개발

서 론

꿀벌이 생산하는 벌꿀, 프로폴리스, 로얄젤리, 화분, 봉독 등의 양봉산물은 식품, 의약품, 화장품 등 다양한 소재로 활용되고 있다(Bogdanov et al., 2008). 특히 벌꿀은 인류가 오래전부터 사용한 천연 감미료이자 국내 양봉산업에서 약 80%정도 차지하는 국내 양봉농가의 주요 소득원으로 알려져 있다. 벌꿀의 구성성분으로는 당류(포도당, 과당 등) 및 수분이 80%이상 차지하고 이외에 플라보노이드를 포함한 페놀성 화합물 등 밀원식물 유래 2차 대산산물, 단백질, 비타민, 미네랄 등이 미량으로 함유되어 있다(Chang et al., 1988; Can et al., 2015). 벌꿀의 생리활성으로는 항산화 효과(Shen et al., 2015) 및 항균 효과(Deng et al., 2018)가 대표적으로 알려져 있으며, 최근에는 설치류를 이용한 in vivo에서 간보호 효과(Zhao et al., 2018)가 보고되었다. 벌꿀은 밀원식물에 따라 아카시아꿀, 밤꿀, 피나무꿀, 잡화꿀 등으로 분류되며, 벌꿀의 품질은 Codex 및 식품공전에 고시된 수분, 전화당, 자당, 산도, 이성화당 등의 항목을 분석하여 평가되고 있다(Codex, 2001; KFDA, 2016). 하지만 Leptospermum scoparium 유래 마누카꿀과 같이 항균효과를 가지는 생리활성물질(methylglyoxal)을 규명(Alvarez-Suarez et al., 2014)하는 등 해외에서는 순수 밀원 벌꿀에 대한 성분 연구 및 생리활성 검증을 통하여 품질평가 기준을 마련하고 있으나, 국내에서는 순수 밀원 벌꿀에 대한 성분연구는 미진한 실정이다. 이에 본 연구에서는 국내 벌꿀 생산량의 70% 이상을 차지하고 맛과 향기가 우수하여 국내 소비자가 가장 선호하며, 위궤양 등 위장질환 유발균 Helicobacter pylori에 대하여 항균활성(Kim et al., 2017)을 가지는 국산 아카시아꿀을 이용하여 국산 아카시아꿀 내 항헬리코박터균 활성 물질로 알 려 진 abscisic acid를 지 표 로 UPLC(ultra performance liquid chromatography) 품질평가법을 개발하고자 하였다.

재료 및 방법

시료 전처리 및 UPLC 분석조건

우리나라 8개 지역에서 수집한 아카시아꿀에 methanol을 넣어 0.5g/mL로 만들고 초음파 추출기를 이용하여 30분 동안 추출한 후 0.2μm 멤브레인 필터로 여과한 다음 분석에 사용하였다. 표준품 abscisic acid는 1mg/mL로 만들어 시료 전처리법과 동일하게 실시하였으며 4°C 냉장고에 보관하여 분석 직전에 희석하여 사용하였다. 국산 아카시아꿀 내 abscisic acid의 분석은 photodiode array detector, binary pump, auto sampler가 장착된 Waters(Minneapolis, MN, USA) ACQUITY UPLC I-Class를 사용하였으며 UPLC 분석 조건은 Table 1과 같다.

Table 1.

UPLC conditions for abscisic acid in Korean acacia honey

결과 및 고찰

분석법 최적화

국산 아카시아꿀의 밀원유래 성분이자 H. pylori에 대한 항균활성을 가지는 acscisic acid을 생리활성 지표물질로 설정하여 신속하고 정확한 UPLC 분석법을 최적화하고자 하였다. Abscisic acid와 인접한 피크의 분리도를 증가시키기 위하여 고정상이 서로 다른 RP-amide, C18, Phenyl-Hexyl 컬럼, 이동상의 pH 및 컬럼 온도 변화를 주어 이상적인 분석조건을 탐색하였다. 그 결과, C18(2.1×100mm, 2μm) 컬럼에 이동상을 MeCN과 0.1%H₃PO₄를 사용하고 컬럼온도를 40°C롤 설정하였을 때, 국산 아카시아꿀 내 abscisic acid의 피크는 인접한 피크와 2.0이상의 분리도를 보였으며 머무름 시간(retention time, Rt)은 5.607분으로 6분이내 분석이 가능하였다(Fig. 1). 검출파장은 abscisic acid의 UV 스펙트럼(200~400nm)을 추출하여 강한 흡수를 보이는 263nm로 설정하였다. 본 UPLC 분석법은 고압력의 펌프와 HPLC에 사용하는 컬럼보다 상대적으로 충진제 입자가 작은 컬럼을 사용하여 Yao 등(2003)이 보고한 마누카꿀에서 abscisic acid의 HPLC분석보다 5분정도 빠르게 검출이 가능하였으며, abscisic acid의 peak tailing 및 peak resolution을 증가시켜 기존의 HPLC 분석법보다 신속하고 효율적이었다.

Fig. 1.

UPLC chromatograms of (A) abscisic acid and (B) Korean acacia honey at 263nm.

분석법 밸리데이션

국산 아카시아꿀의 품질평가를 위한 UPLC 분석법의 타당성을 검증하기 위하여 특이성, 직선성, 검출한계, 정량한계, 정밀성, 정확성을 평가하였다. 국산 아카시아꿀의 생리활성 지표물질 abscisic acid의 분리 특이성은 표준품과 아카시아꿀의 UPLC 크로마토그램에서 동일한 머무름 시간에 검출되는 피크의 UV 스펙트럼 일치여부로 평가한다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 표준품과 시료 내 동일한 머무름 시간을 가지는 피크와 200~400nm에서 동일한 패턴을 나타내었으며 피크의 순도는 양호하여 분석방법의 분리 특이성을 확인하였다. 직선성은 1, 5, 10, 50, 100μg/mL의 5가지 농도를 사용하여 UPLC 분석조건으로 측정한 결과, 검량선의 상관계수는 0.9999이상으로 양호한 직선성과 정량할 수 있는 회귀방정식(Y=18512x-12323)을 작성할 수 있었다(Table 2). Abscisic acid의 검출한계 및 정량한계는 0.01μg/mL과 0.04μg/mL로 미량의 성분도 검출 및 정량이 가능하였다(Table 2). 분석 시간 변동에 따른 분석시료의 함량변화를 확인하기 위하여 5, 10, 50μg/mL 3가지 농도에 대한 일내 정밀도 및 일간 정밀도를 측정한 결과, 일내 정밀성은 상대표준편차(RSD) 1.92~3.83%이었으며, 일간 정밀성은 상대표준편차 0.13~0.40%로 상대표준편차 5%이내의 우수한 정밀성 가지는 것으로 확인되었다(Table 3). 또한 분석조건의 정밀성 평가 항목인 반복성에서는 국산 아카시아꿀을 0.25, 0.5, 1.0g/mL 3가지 농도에서 6회 반복 측정하였을 때, 상대표준편차 1% 미만이었다(Table 4). 분석조건의 정확성은 지표성분의 회수율을 측정하여 평가하였다. 전남지역에서 수집한 국산 아카시아꿀 0.5g/mL에 abscisic acid 5, 10, 20μg/mL의 3가지 농도를 spiking하여 분석한 결과, 각 농도에 대한 회수율은 94.2~98.1%로 10%범위내로 나타났으며 개발된 분석방법은 양호한 정확성을 가지는 것으로 확인되었다(Table 5).

Fig. 2.

Comparison of UV spectrum of (A) standard and (B) acacia honey for specificity of the UPLC method.

Table 2.

Linearity regression, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) for abscisic acid in Korean acacia honey

Table 3.

Precision result of intra- and inter-day variability for abscisic acid

Table 4.

Repeatability result of abscisic acid in Korean acacia honey

Table 5.

Recovery result of the analytical method

분석법 적용 함량 평가

현재 꿀벌에 의하여 생산된 천연벌꿀 및 사양벌꿀에 대한 품질평가 및 규격은 식품공전 고시되어 있지만 순수 밀원 벌꿀에 대한 품질평가법이 존재하지 않는다. 본 연구에서는 국산 아카시아꿀의 생리활성 물질 abscisic acid(Kim et al., 2017)를 지표로 순수 밀원 벌꿀에 대한 품질평가법을 제시하고자 UPLC를 이용하여 품질평가법의 개발 및 검증하였다. 확립된 UPLC 품질평가법을 8개 지역에서 생산된 국산 아카시아꿀에 적용하였다(Fig. 3). 그 결과, 국산 아카시아꿀에 존재하는 abscisic acid의 함량은 12.5~45.7mg/kg로 나타났으며, 충북 지역에서 생산한 아카시아꿀에 abscisic acid가 45.7mg/kg로 가장 높은 함량을 보였다(Table 6). Ediriweera and Premarathna 등(2012)은 벌꿀에 포함된 밀원식물 유래 화학적 성분들은 밀원식물이 서식하는 지역적 기후, 토양에 따라 차이를 보이며, 이는 벌꿀의 생리활성에도 영향을 끼는 것으로 보고되었다. 국산 아카시아꿀의 지역별 abscisic acid의 함량차이 역시 밀원식물인 아까시나무(Robinoa pseucdoacacia) 분포도, 지역적 환경차이에 의한 것으로 생각된다.

Fig. 3.

UPLC chromatograms of Korean acacia honeys collected from different areas. 1: Gangwon, Cheorwon; 2: Gyeonggi, Siheung; 3: Chngbuk, Goesan; 4: Chungnam, Cheongyang; 5: Jeonbuk, Iksan; 6: Jeonnam, Haenam; 7: Gyeongbuk, Yeongju; 8: Gyungnam, Changnyeong.

Table 6.

Content of abscisic acid in acacia honeys collected from different regions in Korea

적 요

본 연구에서는 국산 아카시아꿀의 품질관리 및 품질평가를 위하여 H. pylori에 대한 생리활성 물질 abscisic acid를 지표로 UPLC를 이용하여 품질평가법을 개발하였다. UPLC 분석법은 Halo C18(2.1×100mm, 2μm) 컬럼, MeCN과 0.1% phosphoric acid의 기울기조건 및 검출파장 263nm에서 국산 아카시아꿀 내 abscisic acid는 6분 이내에 정량분석이 가능한 2.0 이상의 완벽한 분리도를 나타냈으며, 특이성, 직선성, 검출한계, 정량한계, 정밀성(일내 및 일간 정밀도, 반복성), 정확성(회수율) 평가를 통하여 완벽하게 검증되었다. 확립된 분석방법은 국산 아카시아꿀 내 abscisic acid의 정량분석에 충분히 적용할 수 있었으며, 국산 아카시아꿀을 포함한 순수 밀원 국산 벌꿀에 대한 품질관리 및 품질평가를 위한 기초자료로 사용할 수 있을 것이라 기대된다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 어젠다 연구사업(과제번호: PJ01408001)에 의하여 수행되었으므로 감사를 드립니다.

References

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