국내산 화분 (Bee pollen)의 항산화 및 혈관신생 억제 활성

서 론

벌 화분 (Bee pollen)은 꿀벌들이 꽃에서 꽃꿀을 수집할 때 뒷다리에 붙은 꽃가루와 꿀, 타액 등을 뭉쳐 수집한 것으로 꿀벌의 단백질원이자 생명유지와 성장에 필수적인 물질이며 로열젤리 (royal jelly)의 원료로도 이용된다 (Leblanc et al., 2009; Silva et al., 2014). 또한 탄수화물, 단백질, 지질, 비타민 및 무기질 등의 영양성분을 비롯하여, 페놀성 화합물 (phenolic compounds) 및 플라보노이드 (flavonoids)와 같은 생리활성물질이 풍부하여 완전한 식품으로 일컬어지고 있다 (Serra Bonbehí and Escolà Jordà, 1997; Feás, 2012). 화분의 화학 성분은 수확지역, 기후, 토양 상태 등 환경조건에 따라 달라지며 주로 식물의 종에 따라 달라지는 것으로 알려져 있다 (Feás et al., 2012).

활성산소 (Reactive Oxygen Species, ROS)는 정상적인 세포의 대사과정에서 생성되며 체내의 병원체를 공격하여 생체 방어작용을 한다. 그러나 활성산소는 불안정한 상태로 반응성이 높으므로 탄수화물, 단백질, 지질 및 핵산 등 생체 조직을 무차별적으로 공격하여 체내를 산화시키기도 한다 (Siems et al., 1995; Wang et al., 1996; Halliwell and Gutteridge, 1999; Marnett, 1999; Stadtman, 2004; Valko et al., 2006). 이러한 체내 과잉 생성된 활성산소로 인해 산화 균형이 깨진 상태를 산화 스트레스 (oxidative stress)라고 하며, 이는 노화와 암, 동맥경화, 당뇨병 등의 퇴행성 질환을 유발하는 것으로 보고되고 있다 (Yeh et al., 2003; Birben et al., 2012).

활성산소가 체내 필수 물질과 반응하기 전에 먼저 반응하여 세포의 산화를 억제하는 물질을 항산화제라고 한다. 페놀성 화합물과 같은 파이토케미컬 (phytochemicals)은 산화 스트레스를 줄이고 분자의 산화를 억제함으로써 퇴행성 질환의 위험을 감소시키는 것으로 보고되어 왔다 (Silva et al., 2004; Morais et al., 2011). 파이토케미컬은 식물류에 널리 존재하며 일반적으로 플라보노이드 (flavonoids), 카로티노이드 (carotenoids), 알칼로이드 (alkaloids), 탄닌 (tannins) 등이 있다. 특히 화분의 항산화 활성은 화분에 존재하는 페놀성 화합물과 플라보노이드 등과 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 그밖에도 항곰팡이, 간 보호, 항암 및 항염증 등의 효과가 있는 것으로 보고되고 있다 (Campos et al., 2003; Basim et al., 2006; Klarić et al., 2018).

혈관신생 또는 새로운 혈관의 성장은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 과정이며, 세포는 혈관을 통해 영양분과 산소를 공급받으므로 암 세포의 성장과 전이에도 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Folkman, 1971). 따라서 혈관신생의 억제는 암세포의 성장 지연과 더불어 암의 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있는 것으로 기대되므로 현재 혈관신생 억제제에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다 (Holleb and Folkman, 1972; Folkman, 1995; Tosetti et al., 2002). 양봉산물 중에서는 프로폴리스와 일부 꿀에 대한 혈관신생 억제활성 연구들이 보고되고 있으며, 국내에서 수집된 화분에 대하여 혈관신생 억제활성을 평가한 연구는 전무하다.

유럽을 비롯한 남미, 일본 등에서는 이미 오래 전부터 양봉산물에 대한 연구가 진행되어 왔으며, 가공식품뿐 아니라 의약품으로도 생산·개발되어 소비되고 있는 추세이다 (Kroyer and Hegedus, 2001). 최근 우리나라에서도 화분이 건강보조식품으로 각광받으며 수요가 지속적으로 증가하고 있으나 현재 국내에서 유통 중인 화분의 대부분은 수입산에 의존하고 있으며, 또한 국내산 화분의 구성성분 및 기능성 등에 대한 연구는 아직 충분하지 않은 실정이다. 따라서 본 연구는 국내산 화분의 항산화 및 혈관신생 억제 활성을 평가하여 화분의 유용성 및 기능성에 대한 기초 자료를 제공하고자 한다.

본 연구에서는 국내산 화분의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 분석하여 특성을 파악하고, 더 나아가 기능성 식품소재로서 화분을 활용하기 위하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)에 대한 free radical-scavenging activity, 2,2ʹ-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical cation decolorization, 그리고 ferric reducing ability of plasma (FRAP) assay를 통해 화분의 항산화 효능을 평가하였다. 뿐만 아니라 tube formation assay (in vitro)를 이용하여 인간 제대정맥 내피세포 (Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)에 대한 국내산 화분의 혈관신생 억제 활성을 평가하였다.

재료 및 방법

Bee pollen 시료

본 실험에 사용한 화분 시료는 국내산 화분 (12개)의 경우 2018년도, 국외산 화분 (3개)의 경우 2017년도에 생산된 것으로 한국양봉협회로부터 제공받아 분석하였다 (Table 1). 국내산 (B1~B12) 화분은 국내 다양한 지역으로부터 수집되었으며, 수입산 (B13~B15) 화분은 스페인, 베트남, 중국산 화분을 사용하였다. 단, 본 실험에서 시료의 상세는 모두 블라인드로 진행하였으며 제공받은 화분은 모두 밀폐된 상태로 -20℃에서 냉동 보관하였다.

Table1.

Collecting cities, province, sources of bee pollens

결과 및 고찰

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

국내산 (B1~B12) 화분 12개와 수입산 (B13~B15) 화분 3개에 대한 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 분석한 결과 Table 2와 같다. 전체 화분 (B1~B15) 시료의 총 폴리페놀 함량은 22.51±1.46~145.39±2.71 mg/g of EEBP 범위로 넓게 분포하고 있으며, 평균 함량은 51.63±1.25 mg/g of EEBP로 측정되었다. 특히 국내산 (B1~B12) 화분의 총 폴리페놀 함량은 평균 57.67±1.56 mg/g of EEBP으로, 수입산 (B13~B15) 화분의 평균 함량 (27.48±0.28 mg/g of EEBP)보다 약 2배 정도 더 높은 수치를 나타내었다. 경북 의성 (B10)에서 수집된 화분의 총 폴리페놀 함량은 145.39±2.71 mg/g of EEBP로 다른 화분 시료에 비해 월등히 높았으며, 제주 1 (B5), 경남 산청 (B9)에서 수집된 화분 또한 각 80.03±2.64 mg/g of EEBP, 75.09±2.26 mg/g of EEBP로 높게 나타났다. 반면 제주 2 (B6), 베트남 (B14), 중국 (B15)에서 수집된 화분의 경우 30 mg/g of EEBP 미만으로 낮은 폴리페놀 함량을 나타내었다. 제주 1, 2 (B5, B6)에서 수집된 화분의 경우 같은 지역에서 수집되었으나 총 폴리페놀 함량에 크게 차이를 나타내었는데, 이는 수집된 식물의 종, 색상 등에 차이가 있음을 보아 밀원식물이 다른 것에 기인된 것으로 사료된다. Ulusoy와 Kolayli (2013)가 보고한 터키산 화분의 총 폴리페놀 함량은 44.07~124.10 mg/g pollen 범위로 본 실험결과와 유사하게 나타났으며, 동결건조한 국내 다래 화분의 총 페놀 함량은 26.027 mgGAE/1000 mL로 보고된 바 있다 (홍 등, 2015).

Table 2.

Total polyphenol and flavonoid contents of EEBP

화분 시료 15개에 대한 총 플라보노이드 함량을 분석한 결과 9.14±0.44~56.40±0.01 mg/g of EEBP 범위로, 평균 함량은 29.94±0.67 mg/g of EEBP로 측정되었다. 국내산 (B1~B12) 화분의 평균 플라보노이드 함량은 32.77±0.67 mg/g of EEBP로 앞서 측정한 폴리페놀 함량과 마찬가지로 수입산 (B13~B15, 18.62±0.68 mg/g of EEBP) 화분보다 높은 플라보노이드 함량을 나타내었다. 그리고 제주 1 (B5), 경남 산청 (B9), 경북 의성 (B10), 중국 (B15)에서 수집된 화분을 제외한 대부분의 화분은 플라보노이드가 페놀 함량의 대부분을 차지하는 것으로 나타났다. 특히 경남 산청 (B9)에서 수집된 화분의 플라보노이드 함량은 56.40±0.01 mg/g of EEBP으로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 전북 고창 (B3), 전남 함평 (B4), 강원 양양 (B7)에서 수집된 화분의 경우도 40 mg/g of EEBP가 넘는 높은 플라보노이드 함량을 나타내었다. 반면, 경북 의성 (B10)에서 수집된 화분의 경우 높은 페놀 함량에 비해 비교적 낮은 플라보노이드가 함유되어 있는 것을 확인하였다. 각 화분의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량의 차이는 화분의 품질을 결정하는데 중요한 요인으로 생각되며, 본 실험결과 국내산 (B1~B12) 화분은 높은 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 나타내고 있으므로 이로 인한 다양한 생리활성 등이 기대된다. 또한 화분 내 폴리페놀 성분의 대다수가 플라보노이드라고 알려져 있으나 일부 화분 시료의 경우 비플라보노이드 성분이 많이 함유된 경우도 있으므로 상세 구성성분 분석에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

항산화 활성 평가

DPPH radical 소거능 평가

DPPH (2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate) radical 소거능은 산화방지제의 수소공여능을 측정함으로서 항산화능을 평가하는 대표적인 지표로 널리 이용되고 있다 (Ancerewicz et al., 1998; Miliauskas et al., 2004). 최종 농도 200 μg/mL로 첨가한 EEBP의 DPPH radical 소거능 결과는 Fig. 1과 같으며, 활성의 비교를 위해 사용된 BHT와 VE는 EEBP 1/10 농도에서 측정되었다. 각 화분 시료에 대한 항산화 활성은 2.81±0.67~89.02±1.62%로 나타났다. 국내산 (B1~B12) 화분의 DPPH free radical 소거능은 평균 57.58±1.42%, 수입산 (B13~B15) 화분의 radical 소거능은 평균 11.91±1.39%로 앞서 평가한 폴리페놀 함량 (Table 1)의 경향과 유사하게 나타났다. 제주 2 (B6), 강원 원주 (B8), 베트남 (B14), 중국 (B15)에서 수집된 화분을 제외한 모든 화분 시료는 positive control로 사용된 BHT (19.71±2.13%)보다 높은 활성을 나타내었다. 그리고 전북 고창 (B3), 전남 함평 (B4), 경남 산청 (B9), 경북 의성 (B10), 충남 금산 (B12)에서 수집된 화분의 경우 80% 이상의 높은 free radical 소거능을 보였으며, 특히 경북 의성 (B10)에서 수집한 화분의 DPPH free radical 소거능은 89.02±1.62%로 control로 사용된 천연 항산화제인 VE (88.61±1.94%)보다 높은 활성을 나타내었다. 반면 베트남 (B14)과 중국 (B15)에서 수집된 화분의 free radical 소거능은 각각 2.81±0.67%, 4.20±1.46%로 매우 낮은 활성을 나타내었다. 국내산을 포함한 모든 화분 (B1~B15) 시료의 DPPH free radical 소거능과 화분의 총 폴리페놀 함량과의 상관관계를 살펴본 결과 상관계수 R²은 0.480으로 나타났으며, 국내에서 수집된 화분의 DPPH free radical 소거능은 폴리페놀류의 기여가 있는 것으로 사료된다 (data not shown).

Fig. 1.

DPPH free radial-scavenging activity of EEBP (B1~B15). B1, Gyeonggi Namyangju 1; B2, Gyeonggi Namyangju 2; B3, Jeonbuk Gochang; B4, Jeonnam Hampyeong; B5, Jeju 1; B6, Jeju 2; B7, Gangwon Yangyang; B8, Gangwon Wonju; B9, Gyeongnam Sancheong; B10, Gyeongbuk Uiseong; B11, Gyeongbuk Youngdong; B12, Chungnam Geumsan; B13, Spain; B14, Vietnam; B15, China; BHT, butylated hydroxytoluene; VE, α-tocopherol. Measurements were carried out in triplicate. Means and standard deviations are indicated.

홍 등 (2014)은 국내산 도토리 화분과 다래 화분의 DPPH free radical 소거활성을 측정한 결과, 동결건조한 화분의 경우 물 추출물보다 에탄올 추출물에서 항산화능이 더욱 높아지며 radical 소거 활성은 각각 81.01±2.93%, 23.25±0.97%로 보고한 바 있다. 그리고 국내 메밀 화분과 벼 화분의 항산화능은 각각 8.10%, 36.09%라고 보고하였다 (홍 등 2016; 홍 등, 2017). Leja 등 (2007)도 폴란드의 크라쿠프 지역에서 토끼풀 (Trifolium sp.)을 포함한 12종의 화분에 대한 DPPH free radical 소거능을 분석한 결과 8.6~91.3%로 국내산 (B1~B12) 화분 시료와 비슷한 활성을 나타내었다. 이와 같이 국내에서 수집된 화분일지라도 수집 지역, 화분 내 함유 구성 성분과 그 함유량, 식물의 종 등에 따라 활성에 차이를 나타내는 것으로 사료된다.

ABTS radical 소거능 평가

전체 15개 화분 시료는 최종 농도 100 μg/mL의 EEBP로 평가하였으며 이에 대한 각 EEBP의 ABTS radical 소거능을 통해 항산화 활성을 분석하였다. 그 결과 EEBP의 ABTS radical 소거능은 28.19±3.66~93.34±0.07%이며, 국내산 (B1~B12) 및 수입산 (B13~B15) 화분의 평균은 각각 61.86±1.10%, 35.75±4.53%로 측정되었다 (Fig. 2). 경남 산청 (B9), 경북 의성 (B10)에서 수집된 화분의 ABTS radical 소거능은 각각 90.63±0.56%, 93.34±0.07%로 앞서 평가한 DPPH free radical 소거능 결과 (Fig. 1)와 같이 우수한 ABTS radical 소거능을 나타내었다. 이는 최종 농도 50 μg/mL의 positive control (BHT, Trolox 및 VE)에 대한 ABTS radical 소거능과 유사한 수치를 나타내었다. 그 다음으로 전북 고창 (B3), 충남 금산 (B12), 제주 1 (B5), 전남 함평 (B4)에서 수집된 화분이 각각 72.12±8.94%, 67.64±2.76%, 66.07±3.91%, 64.12±2.49%의 ABTS radical 소거활성을 나타내었다. 반면, 총 폴리페놀 함량 (Table 1)이 낮았던 베트남 (B14), 중국 (B15)에서 수집된 화분의 경우 ABTS radical 소거능 또한 낮게 측정되었다. 본 실험에서도 국내산 (B1~B12) 화분의 ABTS radical 소거능이 수입산 (B13~B15) 화분보다 2배 이상 높은 값을 나타내었으며 매우 우수한 것으로 평가되었다.

Fig. 2.

ABTS radial-scavenging activity of EEBP (B1~B15). B1, Gyeonggi Namyangju 1; B2, Gyeonggi Namyangju 2; B3, Jeonbuk Gochang; B4, Jeonnam Hampyeong; B5, Jeju 1; B6, Jeju 2; B7, Gangwon Yangyang; B8, Gangwon Wonju; B9, Gyeongnam Sancheong; B10, Gyeongbuk Uiseong; B11, Gyeongbuk Youngdong; B12, Chungnam Geumsan; B13, Spain; B14, Vietnam; B15, China; Trolox, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid; BHT, butylated hydroxytoluene; VE, α-tocopherol. Measurements were carried out in triplicate. Means and standard deviations are indicated.

박 등 (2013)이 보고한 한국산 참나무류 화분의 ABTS radical 소거활성은 90% 이상이었으며, 본 실험에서 분석한 경남 산청 (B9), 경북 의성 (B10)에서 수집된 화분은 이와 유사한 활성을 나타내었다. ABTS radical 소거능은 DPPH free radical 소거능 (Fig. 1)과 유사한 패턴의 결과를 나타내었으나, BHT를 포함한 positive control과 대부분 화분의 활성 수치는 DPPH radical 소거능 평가법 결과보다 다소 높게 나타났다. 이는 radical 측면에서 볼 때 DPPH는 안정한 free radical이나 ABTS는 양이온 radical이라는 차이가 있으며, 또한 DPPH는 주로 지용성 물질의 항산화능을 측정하는데 반해 ABTS는 수용성과 지용성 물질의 항산화능을 모두 측정할 수 있다는 점 등에 따라 다소 차이를 나타내는 것으로 사료된다 (Baltrušaitytė, 2007).

FRAP 활성 평가

Ferric reducing ability of plasma (FRAP) 분석법은 colored ferrous tripyridyl triazine complex에 의해 ferric tripyridyltrizaine (Fe³⁺-TPTZ) 복합체가 낮은 pH에서 환원제에 의해 ferrous tripyridyltriazine (Fe²⁺-TPTZ)으로 전환되어지는 과정을 분석함으로써 시료 내의 항산화 능력을 측정하는 방법이다 (Benzie and Strain, 1996).

본 연구에 사용된 화분 (B1~B15) 시료는 5 mg/mL 농도의 EEBP를 이용하였으며, 이에 대한 FRAP 활성은 BHT 및 VE 1/10 농도와 비교하여 평가하였다 (Fig. 3). FRAP 활성은 전체 평균 78.49±3.85 μg/mL로, 국내산 (B1~B12) 및 수입산 (B13~B15) 화분의 평균 FRAP 활성은 각각 85.60±4.37 μg/mL, 31.99±3.31 μg/mL로 측정되었다. 특히 경북 의성 (B10)에서 수집된 화분의 FRAP 활성은 172.55±9.66 μg/mL로 천연 항산화제 VE (130.38±7.53 μg/mL)보다 더욱 높은 항산화 활성을 나타내었다. 이어서 경남 산청 (B9), 전남 함평 (B4), 전북 고창 (B3), 충남 금산 (B12), 강원 양양 (B7) 순으로 높은 FRAP 활성을 나타내었으며, 이는 합성 항산화제인 BHT (80.72±7.25 μg/mL)보다 높은 항산화 활성을 나타내었다. 또한 이들 시료는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, DPPH radical scavenging activity, ABTS radical cation-scavenging activity 결과에서도 모두 높은 활성을 나타내었다 (Table 1, Figs. 1, 2).

Fig. 3.

FRAP activity of EEBP (B1~B15). B1, Gyeonggi Namyangju 1; B2, Gyeonggi Namyangju 2; B3, Jeonbuk Gochang; B4, Jeonnam Hampyeong; B5, Jeju 1; B6, Jeju 2; B7, Gangwon Yangyang; B8, Gangwon Wonju; B9, Gyeongnam Sancheong; B10, Gyeongbuk Uiseong; B11, Gyeongbuk Youngdong; B12, Chungnam Geumsan; B13, Spain; B14, Vietnam; B15, China; BHT, butylated hydroxytoluene; VE, α-tocopherol. Measurements were carried out in triplicate. Means and standard deviations are indicated.

본 연구에서 분석한 화분 시료의 FRAP activity와 총 폴리페놀 함량과의 상관관계를 살펴본 결과, 상관계수 R²은 0.671로 시료에 함유된 총 폴리페놀 함량과 높은 상관관계가 있음을 확인하였다 (data not shown). 반면 수입산 (B13~B15) 화분은 총 폴리페놀 함량을 포함한 모든 항산화 평가에서 국내산 화분 (B1~B12)보다 낮은 활성을 나타내었다.

Fig. 4.

Tube formation assay with EEBP (B1~B15) on HUVECs. HUVECs were sandwiched between two layers of collagen gel and induced to form blood vessel-like tubes. The final concentration of EEBP was 400 μg/mL. Ctrl, Control; B1, Gyeonggi Namyangju 1; B2, Gyeonggi Namyangju 2; B3, Jeonbuk Gochang; B4, Jeonnam Hampyeong; B5, Jeju 1; B6, Jeju 2; B7, Gangwon Yangyang; B8, Gangwon Wonju; B9, Gyeongnam Sancheong; B10, Gyeongbuk Uiseong; B11, Gyeongbuk Youngdong; B12, Chungnam Geumsan; B13, Spain; B14, Vietnam; B15, China. Scale bar, 100 μm.

홍 등 (2014)은 동결건조한 국내 도토리 화분 및 다래 화분의 FRAP 활성을 측정한 결과, 물 추출물보다 에탄올 추출물에서 활성이 더 높게 나타났으며 그 값은 각각 3.89±0.04%, 2.37±0.03%로 보고한 바 있다. 또한 양봉산물인 propolis의 주요 구성성분에 따른 FRAP activity를 분석한 결과 artepillin C, p-coumaric acid, galangin은 BHT보다 우수한 항산화 활성을 가지며, caffeic acid phenethyl ester, kaempferol, quercetin 등은 천연 항산화제인 VE보다 우수한 활성을 가지는 것으로 보고된 바 있다 (Ahn et al., 2009). 특히 경북 의성 (B10)에서 수집된 화분을 포함한 일부 국내산 화분은 합성 항산화제인 BHT보다 높은 항산화 활성을 나타내었으며 이는 천연 산화방지제로서의 가능성이 매우 높은 것으로 보여진다. 따라서 국내산 (B1~B12) 화분의 밀원식물, 구성성분에 대한 체계적인 분석이 필요하며 이에 대한 지속적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.

적 요

벌 화분 (Bee pollen)은 꽃에서 수집되어 꿀벌이 포장·운반하며 꿀벌의 주식으로 사용되므로 꿀벌의 성장과 생존에도 필수적이다. 화분은 다양한 폴리페놀 및 플라보노이드 성분으로 인해 우수한 항산화 능력을 가진 것으로 보고되고 있다. 따라서 본 연구는 국내 다양한 지역으로부터 화분을 수집하고, 에탄올 추출물 (ethanol extracts of the bee pollen, EEBP)을 조제하여 국내산 화분의 항산화 및 혈관신생 억제 활성과 같은 생리활성을 평가하고자 실시되었다. 본 연구결과, 국내산 화분의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 25.61±3.75~145.39±2.71 mg/g of EEBP, 11.68±0.47~56.40±0.01 mg/g of EEBP로 나타났다. 또한 EEBP의 DPPH free radical 소거 활성, ABTS radical 양이온 소거능, 그리고 ferric reducing/antioxidant power (FRAP) assay를 이용하여 항산화 활성을 평가하였다. 그 결과, DPPH free radical 소거능, ABTS radical 양이온 소거활성 및 FRAP 분석 모두에서 국내산 (B1~B12) 화분이 수입산 (B13~B15) 화분보다 강력한 항산화 활성을 나타내었다. 특히 경북 의성 (B9), 경남 산청 (B10)에서 수집된 화분의 경우, 모든 항산화 실험에서 positive control로 사용된 천연 항산화 물질인 VE와 유사하거나 더 높은 활성을 나타내었다. 그리고 tube formation assay 실험결과, 대부분 시료의 경우 HUVECs의 관강 형성을 약하게 억제하였으나, 특히 제주 1, 2 (B5, B6)와 경남 의성 (B9)에서 수집된 화분의 혈관신생 억제 활성은 다른 화분에 비해 월등히 우수한 것으로 확인되었다.

Acknowledgments

본 연구는 한국양봉자조금위원회의 지원에 의하여 수행되었으며 이에 감사드립니다.

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