New Analytical method for 10-HDA in Royal Jelly using UHPLC

서 론

천연물은 예로부터 질병치료와 건강증진을 목적으로 사용해 왔으며, 최근에는 체지방감소, 혈당조절, 혈행개선, 혈중중성지방감소, 피부개선 등에 도움을 주는 것으로 알려져 있다(Sung et al., 2014). 부작용이 적으면서도 높은 효능을 나타내는 동시에 장기간 복용도 가능하기 때문에 천연물을 원료로 한 기능성 식품에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 로얄제리는 꿀벌의 인두선으로부터 분비되는 물질로서 왕유라고도 하며 여왕벌은 평생동안 로얄제리만 섭취하여 일벌의 40배가 넘는 수명을 가지는 것으로 알려져 있다(Viuda-Martos et al., 2008). 우리나라에는 1900년경에 양봉이 도입된 이래 1960년대 후반부터 로얄제리를 생산하기 시작하였고 항염, 항암, 항산화, 항당뇨, 미백 효과 등 다양한 약리활성을 갖는 것으로 보고 되었다(Kim et al., 2014; Nakaya et al., 2007; Azab et al., 2011; Pourmoradian et al., 2014; Han et al., 2014). 로얄제리의 구성성분으로는 수분, 단백질, 당, 지방산, 아미노산, 비타민, 미네랄 등이 있으며 특히 지방산인 10-hydroxy-2-decenoic acid(10-HDA)는 생로얄제리 및 로얄제리 건조물의 주 생리활성 물질로서 로얄제리 분석의 지표물질로 이용되고 있다(식품의약품안전처, 2014). 로얄제리 내 10-HDA의 분석은 일반적으로 HPLC에 의한 분석이 대부분이며 GC를 사용하여 분석한 연구도 보고되었다(Zhou et al., 2007; Zhou et al., 2014). 최근에는 분석기기의 발달로 HPLC의 단점을 보완 하 여 Ultra high performance liquid chrom atography(UHPLC)가 개발되었다. UHPLC는 2μm 정도의 작은 입자가 충진된 컬럼을 사용하여 5μm 컬럼을 주로 사용하는 HPLC보다 3배 높은 효율성과 70%이상 높은 분리능을 가지고 있을 뿐만 아니라 2배 넘는 고압조건에서 분석이 가능하여 분석소요시간의 감소, 고감도, 높은 분리능, 시료소비량의 감소의 장점을 가지고 있다(Kumar et al., 2012). 이에 본 연구에서는 UHPLC를 이용하여 로얄제리 내 10-HDA의 기존 HPLC 분석방법보다 신속하고 정확한 분석법을 개발하고자 하였으며, 분석방법의 타당성을 입증하는 동시에 지역별로 채집된 로얄제리에 확립된 분석법을 적용하여 함량평가를 실시하고자 하였다.

재료 및 방법

결과 및 고찰

분석조건의 최적화

경기도 안성에서 생산된 로얄제리를 표준으로 하여 UHPLC를 이용한 로얄제리 내 10-HDA의 새로운 분석법을 개발하고자 2.7μm RP-amide 및 1.8 um C18컬럼 등과 이동상의 용매 조성비 변화, 컬럼의 온도변화를 주어 분석조건을 검토하였다. 그 결과, acetonitrile과 0.1%H₃PO₄를 이용한 기울기 조건, 컬럼온도 40°C, 1.8 um C18 컬럼을 사용하였을 때, 10-HDA의 머무름 시간은 2.11분이었으며, 1.83분과 2.44분에 검출되는 피크와의 분리도는 4.0정도로 높은 분리능을 가지는 것으로 확인되었다. 또한 로얄제리 내 검출된 지표성분의 피크와 표준용액의 피크 UV 흡수파장이 일치하여 피크의 순도 역시 양호하였다(Fig. 1).

Fig. 1.

UHPLC chromatograms of raw royal jelly (A, 5mg/mL) and 10-HDA (B, 100μg/mL) at 210nm. IS: internal standard (hesperidin 30μg/mL).

현재 식품공전에 고시된 생로얄제리 및 로얄제리 가공품에 대한 품질평가는 10-HDA를 지표성분으로하여 HPLC 분석이 사용되는데, 이 분석법의 경우 10-HDA의 머무름 시간은 7-10분 사이이며, Kim 등(Kim and Lee, 2010)의 연구에서도 10-HDA의 검출시간은 7분 정도이다. 하지만 본 분석방법은 5분 정도 단축시켜 기존의 방법보다 신속하게 분석할 수 있는 것으로 확인되었다.

직선성, 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOD)

10-HDA의 농도를 300, 100, 50, 10, 5μg/mL로 설정하여UPHLC로 분석한 후 검량선을 작성하였다. 작성된 검량선으로부터 산출된 회귀방정식(y=ax+b)은 Y=4.065x+5.152이었으며, correlation coefficient (R2)는 1.000으로 매우 양호한 양의 상관성을 보였다. 직선식의 기울기와 y절편의 표준편차를 이용하여 검출한계와 정량한계를 계산한 결과 각각 0.24μg/mL, 0.74μg/mL이었다(Table 1).

Table 1 .

Linearity regression, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) for 10-HDA in raw royal jelly

정밀성

분석환경 및 시간 변동에 따른 변화를 확인하기 위하여 10-HDA의 100, 50, 10μg/mL 농도에서 intra-day와 inter-day 정밀성은 RSD 5% 이내에서 평가되었다. 그 결과, intra-day 시험에서 0.27~0.91%의 RSD값을 나타내었고, inter-day 시험에서는 0.43~2.56%의 RSD값을 보였다(Table 2). 또한 로얄제리 시료를 6회 반복 측정하여 반복성(repeatability) 시험을 한 결과 0.26%의 RSD값으로 우수한 정밀성을 나타내었다(Table 3).

Table 2.

Precision result of Intra- and Inter-day variability of 10-HDA

Table 3.

Repeatability result for 10-HDA in raw royal jelly

회수율

로얄제리 시료에 10-HDA 50, 25, 12.5μg/mL를 첨가하여 회수율 시험을 실시하였고 회수율 ±10% 이내에서 분석법의 정확성을 평가하였다. 그결과각농도에 대한 회수율은 각각 98.1, 96.3, 94.2%로 ±10% 범위내로 나타났으며, 분석방법은 정확성을 가지는 것으로 확인되었다(Table 4).

Table 4 .

Recovery result of analytical method

함량평가

UHPLC를 사용하여 개발 및 검증된 분석법을 적용하여 경기도 안성, 강원도 철원, 경상남도 진주로부터 채집된 생로얄제리 내 10-HDA의 함량을 평가하였으며, 그 결과를 Table 5에 나타내었다. 강원도 철원에서 채취된 로얄제리 내 10-HDA함량은 29.7±0.3mg/g으로 경기도 안성과 경상남도 진주에서 채취된 로얄제리보다 각각 29%, 34% 높은 것으로 확인되었다. 현재 우리나라 식품공전에 고시된 생로얄제리 내 10-HDA 함량 기준은 1.6% 이상으로 분석한 모든 로얄제리는 기준보다 월등히 높았으며, EU규정인 1.8% 이상보다 더 높은 것으로 확인되었다. 개발된 분석법은 표준시료로 사용한 안성지역의 로얄제리 뿐만 아니라 타지역에서 채취된 로얄제리의 품질평가에 적용이 가능하였으며, 5분 내에 10-HDA를 신속하고 정확하게 분석할 수 있었다.

Table 5.

Content of 10-HDA in raw royal jelly collected from various countries

결 론

로얄제리는 다양한 활성을 지닌 기능성 식품소재로서 활용되고 있으며 로열제리의 품질은 10-HDA의 함량을 기준으로 평가된다. 본 연구에서는 HPLC를 이용한 기존의 분석법보다 신속하고 정확한 분석방법을 개발하기 위하여 UHPLC를 이용하였으며, 1.8um C18 컬럼과 (A) acetonitrile과 (B) 0.1%H₃PO₄의 기울기 조건(A: 13~20%, 0~5min)을 사용하여 10-HDA의 검출시간을 5분정도 단축하였다. 확립된 분석법은 직선성, 검출한계, 정량한계, 정밀성, 정확성을 통하여 검증되었으며, 개발된 분석법을 안성, 철원, 진주로부터 생산된 로얄제리의 함량평가에 적용하여 10-HDA의 함량을 분석한 결과, 철원에서 생산된 로얄제리에서 가장 높게 측정되었다. 본 연구결과를 통하여 개발된 다성분 동시분석법은 신속하고 정확하며 신뢰할 수 있는 방법으로 국내산 로얄제리의 품질관리 및 품질평가에 사용되어질 수 있을 것이라 사료된다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 차세대바이오그린21사업(과제번호: PJ00906602)에 의하여 수행되었으므로 감사를 드립니다.

References

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