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New Analytical method for 10-HDA in Royal Jelly using UHPLC
The objective of this study was to develop a new quantitative analytical method for 10-HDA in raw royal jelly by ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC). Analytical method was optimized using ACN/0.1% H3PO4 solvent system for 5 min in C18 column (2.1¡¿50mm, 1.8um). Method validation for 10-HDA was evaluated by linearity, precision (intra- and inter-day), accuracy, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ). The marker compound, 10-HDA showed good linearity (R2=1.000) in the range of 5.0-300.0μg/mL. The LOD and LOQ were 0.24 and 0.74μg/mL, respectively. The relative standard deviation (RSD) of precision variability and accuracy were less than 4%. The results showed that the developed UHPLC method was simple, rapid, accurate and reliable for quality assessment of raw royal jelly
Keywords:
Royal jelly, 10-HDA, UHPLC, Method validation서 론
천연물은 예로부터 질병치료와 건강증진을 목적으로 사용해 왔으며, 최근에는 체지방감소, 혈당조절, 혈행개선, 혈중중성지방감소, 피부개선 등에 도움을 주는 것으로 알려져 있다(Sung et al., 2014). 부작용이 적으면서도 높은 효능을 나타내는 동시에 장기간 복용도 가능하기 때문에 천연물을 원료로 한 기능성 식품에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 로얄제리는 꿀벌의 인두선으로부터 분비되는 물질로서 왕유라고도 하며 여왕벌은 평생동안 로얄제리만 섭취하여 일벌의 40배가 넘는 수명을 가지는 것으로 알려져 있다(Viuda-Martos et al., 2008). 우리나라에는 1900년경에 양봉이 도입된 이래 1960년대 후반부터 로얄제리를 생산하기 시작하였고 항염, 항암, 항산화, 항당뇨, 미백 효과 등 다양한 약리활성을 갖는 것으로 보고 되었다(Kim et al., 2014; Nakaya et al., 2007; Azab et al., 2011; Pourmoradian et al., 2014; Han et al., 2014). 로얄제리의 구성성분으로는 수분, 단백질, 당, 지방산, 아미노산, 비타민, 미네랄 등이 있으며 특히 지방산인 10-hydroxy-2-decenoic acid(10-HDA)는 생로얄제리 및 로얄제리 건조물의 주 생리활성 물질로서 로얄제리 분석의 지표물질로 이용되고 있다(식품의약품안전처, 2014). 로얄제리 내 10-HDA의 분석은 일반적으로 HPLC에 의한 분석이 대부분이며 GC를 사용하여 분석한 연구도 보고되었다(Zhou et al., 2007; Zhou et al., 2014). 최근에는 분석기기의 발달로 HPLC의 단점을 보완 하 여 Ultra high performance liquid chrom atography(UHPLC)가 개발되었다. UHPLC는 2μm 정도의 작은 입자가 충진된 컬럼을 사용하여 5μm 컬럼을 주로 사용하는 HPLC보다 3배 높은 효율성과 70%이상 높은 분리능을 가지고 있을 뿐만 아니라 2배 넘는 고압조건에서 분석이 가능하여 분석소요시간의 감소, 고감도, 높은 분리능, 시료소비량의 감소의 장점을 가지고 있다(Kumar et al., 2012). 이에 본 연구에서는 UHPLC를 이용하여 로얄제리 내 10-HDA의 기존 HPLC 분석방법보다 신속하고 정확한 분석법을 개발하고자 하였으며, 분석방법의 타당성을 입증하는 동시에 지역별로 채집된 로얄제리에 확립된 분석법을 적용하여 함량평가를 실시하고자 하였다.
재료 및 방법
실험 재료 및 시약
본 실험에 사용한 로얄제리는 경기도 안성, 강원도 철원, 경상남도 진주에서 꿀벌(Apis mellifera)로부터 2013년 6월에서 7월사이에 채집한 것을 구입하여 사용하였으며, acetonitrile, methanol, water는 Burdik & Jackson(Muskegon, Ml, USA)사의 HPLC등급으로 사용하였다. 지표성분으로 사용된 10-HDA는 Nacalai tesque(Kyoto, Japan)사에서 구입하였으며, 내부 표준품 hesperidin은 식품의약품안전처(Cheongju, Korea)에서 구입하였다.
로얄제리 및 표준품의 전처리
로얄제리를 용량플라스크에 넣은 후 메탄올을 사용하여 5mg/mL의 농도가 되도록 만들고 40°C에서 30분간 초음파 추출기를 사용하여 추출한 후 0.2μm 필터를 사용하여 여과하였다. 표준품 10-HDA(1mg/mL)는 메탄올을 이용하여 로얄제리 전처리법과 동일하게 실시하였으며, 이때 내부표준품 heperidin의 농도는 30μg/mL이 되도록 하였다. 시료 및 표준용액은 실험 전까지 4°C 냉장고에 보관하였다.
분석기기 및 조건
정량분석에 사용된 기기는 Agilent(Santa clara, CA, USA)사의 auto sampler, column oven, binary pump, diode array detector가 장착된 1290 infinity모델을 이용하였으며 Agilent사의 Zorbax Eclipse Plus C18(2.1×50mm, 1.8μm) 컬럼을 장착하여 유속 1.0mL/min, 주입량 1μL, 컬럼온도 40°C, 검출파장 210nm로 설정하였고, 이동상은 (A) acetonitrile과 (B) 0.1% H3PO4 사용하여 (A) 13∼20% 기울기 조건에서 5분동안 분석하였다.
분석법의 검증
로얄제리 내 10-HDA에 대한 UHPLC 분석법의 타당성을 검증하기 위하여International Conference on Harmonization (ICH) 가이드라인에 따라 밸리데이션 파라미터인 직선성, 정밀성, 정확성(회수율), 검출한계, 정량한계 등을 평가하였다(International conference of harmonization, 1995; 1997).
직선성평가
지표성분의 각 농도에 대한 유의성 확인과 검량선을 작성하기 위하여 지표성분을 methanol를 사용하여 5가지 농도로 단계 희석하였다. 작성된 검량선으로 부터 산출된 회귀방정식은 y=ax+b (a: 직선식의 기울기, x: 시료의 농도, y: 피크의 면적)의 일차방정식으로 나타냈으며 상관계수(R2)를 확인하여 직선성(linearity)을 평가하였다.
검출한계 및 정량한계의 측정
분석물질의 검출한계(limit of detection, LOD)와정량한계(limit of quantification, LOQ)는 검량선에 근거하여 검출한계=3.3×σ/S, 정량한계=10×σ/S (σ: 회귀직선의 y절편 표준편차, S: 검량선의 기울기)의 식에 의해 산출하였다.
정밀성평가
분석시간 변동에 따른 분석물질의 함량변화를 알아보기 위하여 직선성이 확인된 3가지 농도에 대해서 intra-day variability를 3회씩 반복하여 측정하였고, inter-day variability는 실험시작일로부터 48시간, 96시간 후에 각 농도에 대하여 3회 반복하여 측정하였다. 분석 결과는 상대표준편차(RSD) 값으로 나타내어 분석물질의 정밀성(precision)을 평가하였다.
정확성평가
직선성의 범위 내에 이미 알고 있는 3가지 농도를 로얄제리 시료에 첨가하여 3회 반복 측정한 후 평가하였으며, 측정된 결과는 표준용액의 양과 비교하여 정확성(accuracy)의 지표인 회수율(recovery)로 나타내었다.
결과 및 고찰
분석조건의 최적화
경기도 안성에서 생산된 로얄제리를 표준으로 하여 UHPLC를 이용한 로얄제리 내 10-HDA의 새로운 분석법을 개발하고자 2.7μm RP-amide 및 1.8 um C18컬럼 등과 이동상의 용매 조성비 변화, 컬럼의 온도변화를 주어 분석조건을 검토하였다. 그 결과, acetonitrile과 0.1%H3PO4를 이용한 기울기 조건, 컬럼온도 40°C, 1.8 um C18 컬럼을 사용하였을 때, 10-HDA의 머무름 시간은 2.11분이었으며, 1.83분과 2.44분에 검출되는 피크와의 분리도는 4.0정도로 높은 분리능을 가지는 것으로 확인되었다. 또한 로얄제리 내 검출된 지표성분의 피크와 표준용액의 피크 UV 흡수파장이 일치하여 피크의 순도 역시 양호하였다(Fig. 1).
![Fig. 1. Fig. 1.](/xml/03504/ASK_2014_v30n4_313_f001.jpg)
UHPLC chromatograms of raw royal jelly (A, 5mg/mL) and 10-HDA (B, 100μg/mL) at 210nm. IS: internal standard (hesperidin 30μg/mL).
현재 식품공전에 고시된 생로얄제리 및 로얄제리 가공품에 대한 품질평가는 10-HDA를 지표성분으로하여 HPLC 분석이 사용되는데, 이 분석법의 경우 10-HDA의 머무름 시간은 7-10분 사이이며, Kim 등(Kim and Lee, 2010)의 연구에서도 10-HDA의 검출시간은 7분 정도이다. 하지만 본 분석방법은 5분 정도 단축시켜 기존의 방법보다 신속하게 분석할 수 있는 것으로 확인되었다.
직선성, 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOD)
10-HDA의 농도를 300, 100, 50, 10, 5μg/mL로 설정하여UPHLC로 분석한 후 검량선을 작성하였다. 작성된 검량선으로부터 산출된 회귀방정식(y=ax+b)은 Y=4.065x+5.152이었으며, correlation coefficient (R2)는 1.000으로 매우 양호한 양의 상관성을 보였다. 직선식의 기울기와 y절편의 표준편차를 이용하여 검출한계와 정량한계를 계산한 결과 각각 0.24μg/mL, 0.74μg/mL이었다(Table 1).
정밀성
분석환경 및 시간 변동에 따른 변화를 확인하기 위하여 10-HDA의 100, 50, 10μg/mL 농도에서 intra-day와 inter-day 정밀성은 RSD 5% 이내에서 평가되었다. 그 결과, intra-day 시험에서 0.27~0.91%의 RSD값을 나타내었고, inter-day 시험에서는 0.43~2.56%의 RSD값을 보였다(Table 2). 또한 로얄제리 시료를 6회 반복 측정하여 반복성(repeatability) 시험을 한 결과 0.26%의 RSD값으로 우수한 정밀성을 나타내었다(Table 3).
회수율
로얄제리 시료에 10-HDA 50, 25, 12.5μg/mL를 첨가하여 회수율 시험을 실시하였고 회수율 ±10% 이내에서 분석법의 정확성을 평가하였다. 그결과각농도에 대한 회수율은 각각 98.1, 96.3, 94.2%로 ±10% 범위내로 나타났으며, 분석방법은 정확성을 가지는 것으로 확인되었다(Table 4).
함량평가
UHPLC를 사용하여 개발 및 검증된 분석법을 적용하여 경기도 안성, 강원도 철원, 경상남도 진주로부터 채집된 생로얄제리 내 10-HDA의 함량을 평가하였으며, 그 결과를 Table 5에 나타내었다. 강원도 철원에서 채취된 로얄제리 내 10-HDA함량은 29.7±0.3mg/g으로 경기도 안성과 경상남도 진주에서 채취된 로얄제리보다 각각 29%, 34% 높은 것으로 확인되었다. 현재 우리나라 식품공전에 고시된 생로얄제리 내 10-HDA 함량 기준은 1.6% 이상으로 분석한 모든 로얄제리는 기준보다 월등히 높았으며, EU규정인 1.8% 이상보다 더 높은 것으로 확인되었다. 개발된 분석법은 표준시료로 사용한 안성지역의 로얄제리 뿐만 아니라 타지역에서 채취된 로얄제리의 품질평가에 적용이 가능하였으며, 5분 내에 10-HDA를 신속하고 정확하게 분석할 수 있었다.
결 론
로얄제리는 다양한 활성을 지닌 기능성 식품소재로서 활용되고 있으며 로열제리의 품질은 10-HDA의 함량을 기준으로 평가된다. 본 연구에서는 HPLC를 이용한 기존의 분석법보다 신속하고 정확한 분석방법을 개발하기 위하여 UHPLC를 이용하였으며, 1.8um C18 컬럼과 (A) acetonitrile과 (B) 0.1%H3PO4의 기울기 조건(A: 13~20%, 0~5min)을 사용하여 10-HDA의 검출시간을 5분정도 단축하였다. 확립된 분석법은 직선성, 검출한계, 정량한계, 정밀성, 정확성을 통하여 검증되었으며, 개발된 분석법을 안성, 철원, 진주로부터 생산된 로얄제리의 함량평가에 적용하여 10-HDA의 함량을 분석한 결과, 철원에서 생산된 로얄제리에서 가장 높게 측정되었다. 본 연구결과를 통하여 개발된 다성분 동시분석법은 신속하고 정확하며 신뢰할 수 있는 방법으로 국내산 로얄제리의 품질관리 및 품질평가에 사용되어질 수 있을 것이라 사료된다.
Acknowledgments
본 연구는 농촌진흥청 차세대바이오그린21사업(과제번호: PJ00906602)에 의하여 수행되었으므로 감사를 드립니다.
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