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항온 저온 창고 월동은 위도 꿀벌 격리 육종장 (전라북도 부안군 위도면; GPS: 35.591300, 126.279048)의 저온 창고를 이용하였고, 대조군인 야외 월동 지역으로는 위도 꿀벌 격리 육종장과 국립농업과학원 양봉장 (전라북도 완주군 이서면; GPS: 35.829912, 127.039290)으로 선정하였다.

저온 창고 및 야외 월동 지역별 각각 소비 5~6매로 세력이 유사한 일곱 개의 봉군이 사용되었다. 위도 꿀벌 격리 육종장의 저온 창고에서 각각 1℃, 4℃의 온도와 상대습도 약 55~60%의 조건으로 월동하였다. 저온 창고 및 야외 월동 봉군 모두 2020년 11월 24일부터 2021년 3월 2일까지 총 99일 동안 월동을 하였다.

월동기간 중 약 2주에 한 번 봉군의 무게를 기록하였고, 봉군별 일벌 시료를 채집하여 -80℃ 급속냉동고에 보관하였다.

각 유전자의 전사체 발현 정도를 측정하기 위하여 qPCR을 수행하였다. 조건별 채집 일벌 샘플 50마리를 막자사발과 액체질소를 이용하여 균질화하고 RNA extraction kit (QIAGEN, Hilden, Germany)로 total RNA를 추출하였다. 잔여 genomic DNA 제거를 위하여 추출한 total RNA에 DNaseI (TAKARA Korea Biomedical Inc., Seoul, Korea)을 처리하였다. 이 후 2.5 μg의 total RNA를 amfiRivert Platinum cDNA synthesis enzyme (GenDEPOT, TX, USA)로 cDNA 합성에 사용하였다.

실험에 사용한 꿀벌 면역 유전자로 catalase (NM_0011 78069.1), superoxide dismutase (Sod, NM_001178027.1), PPO (AY242387.2), Def1 (NM_001011616.2), defensin 2 (Def2), hymenoptaecin (U15956.1), abaecin (NM_0010 11617.1), apidaecin을, 수명 관련 유전자는 Vg 그리고 JH 발현의 지표가 되는 methyl farnesoate epoxidase (mfe, XM_623572)를 사용하였다.

각 유전자 특이적인 PCR primer를 합성하여 qPCR에 사용하였다 (Table 1). qPCR에는 AccuPower 2X GreenStar qPCR Master Mix (BIONEER, Daedeok, Korea)를 사용하였고, 95℃ 10분, 40 반복의 95℃ 15초, 58℃ 1분의 온도 프로그램으로 QuantStudio5 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에서 유전자의 증폭이 수행되었다. Reference 유전자로 actin related protein 1 (ARP1, NM_001185146.1)을 사용하였다.

그룹 간의 평균 봉군 무게 비교를 위하여 Prism 6.0 (GraphPad, SanDiego, USA) 프로그램으로 각 그룹별 채집한 샘플에 대하여 t 검정 (T-test)으로 분석하였고 p<0.05에서 유의성을 검정하였다.

월동 지역 및 실내 월동 온도에 따라 월동기간 중 봉군의 상태 변화를 판단하기 위하여 봉군 무게를 측정하였다. 4℃ 저온 창고에서 월동한 봉군은 월동 전 평균 19.97±1.51 kg에서 월동 후 평균 17.83±1.38 kg으로 (t(12)=2.8, p=0.017) 평균 2.14±0.3 kg이 감소하여 10.71%의 무게 감소율을 보였다 (Fig. 1). 1℃ 저온 창고에서 월동한 봉군은 월동 전 평균 18.84±1.38 kg에서 월동 후 평균 16.35±1.39 kg으로 (t(12)=3.4, p=0.0057) 평균 2.49±0.17 kg이 감소하여 13.19%의 무게 감소율을 보였다 (Fig. 1). 저온 창고 월동의 대조군인 실외 월동 실험군 중 국립농업과학원 양봉장 (전북 완주군 이서면)에서 월동한 봉군은 월동 전 평균 19.20±1.16 kg에서 월동 후 평균 16.39±1.02 kg으로 (t(12)=4.8, p=0.0004) 평균 2.81±0.76 kg이 감소하여 14.63%의 무게 감소율을 보였으며 위도 꿀벌 격리육종장 (전북 부안군 위도면)에서 월동한 봉군의 경우 월동 전 평균 20.22±1.15 kg에서 월동 후 평균 17.41±1.14 kg으로 (t(12)=4.6, p=0.0006) 평균 2.82±0.36 kg이 감소하여 13.93%의 무게 감소율을 보였다 (Fig. 1). 종합하면 야외 (완주, 위도) 월동 봉군과 1℃ 저온 창고 월동 봉군의 무게 감소율은 순서대로 14.63%, 13.93%, 13.19%로 유의미한 차이를 보이지 않았지만, 4℃ 저온 창고 월동 봉군의 월동 중 무게 감소율은 10.71%로 다른 월동 시험군 대비 유의미하게 낮은 무게 감소율을 보였다.

Fig. 1. 
Changes of the honey bee colony weight during wintering depending on the wintering condition. Colonies weight were measured before wintering (Nov. 24, 2020) and after wintering (Mar. 02, 2021). 4℃: Honey bees wintering in the warehouse where the temperature is 4°C. 1°C: Honey bees wintering in the warehouse where the temperature is 1°C. WJ: Honey bees wintering in Jeollabuk-do Wanju-gun. WD: Honey bees wintering in Wido island. Statistics performed by unpaired t-test, comparing each group of colony weights measured before wintering to that of measured after wintering. *p>0.05, **p>0.01, ***p>0.001.

월동 조건에 따른 꿀벌 봉군 면역력을 판단하기 위하여 월동기간별 일벌의 주요 면역 관련 유전자의 상대적 발현양을 비교하였다.

세포성 면역 시스템에 관여하는 sod, catalase, PPO 전사체의 발현은 월동 중 억제되었고, 월동 종료 후 약 2주가 지난 시점에서 재발현 되었다 (Fig. 2).

Fig. 2. 
Transcriptional expression level of honey bee immune-related genes. X-axis is the sample collection dates during the winter season of 2020~2021. WJ: Honey bees wintering in Jeollabuk-do Wanju-gun. WD: Honey bees wintering in Wido island. 4°C: Honey bees wintering in the warehouse where the temperature is 4°C. 1°C: Honey bees wintering in the warehouse where the temperature is 1°C.

혈림프 활성 (Hemolymph activity)을 갖는 항균 펩티드 (Antimicrobial peptide; AMPs)의 경우 Def1을 제외한 나머지 펩티드의 유전자인 Def2, Hymenoptaecin, Abaecin, Apidaecin의 발현이 월동 중 억제되었으며 월동이 종료되는 3월경 재개되었다. Def1은 월동 중 발현이 점차적으로 증가한 뒤 월동이 종료되는 3월부터 발현이 억제되며 다른 항균 펩티드의 발현과 반대되는 패턴을 보였다 (Fig. 2).

꿀벌의 수명과 관련있는 Vg 전사체는 월동 중 오르내리는 발현 패턴을 보였으며 월동이 종료되는 3월에 발현이 억제되었다. 꿀벌 JH의 발현을 나타낼 수 있는 대체 유전자인 mfe 전사체의 발현은 Vg와 반대로 월동 중 억제상태를 유지한 뒤 월동이 끝나는 3월에 발현을 재개하였다 (Fig. 3).

Fig. 3. 
Transcriptional expression level of the honey bee lifespan-related genes. X-axis is the sample collection dates during the winter season of 2020~2021. WJ: Honey bees wintering in Jeollabuk-do Wanju-gun. WD: Honey bees wintering in Wido island. 4°C: Honey bees wintering in the warehouse where the temperature is 4°C. 1°C: Honey bees wintering in the warehouse where the temperature is 1°C.

월동기간 꿀벌은 열 손실을 최소화하고 온도를 유지하기 위하여 봉구를 형성한다. 월동기 봉군 중심부의 온도는 최저 약 12℃, 최고 약 33.5℃를 오가며 평균 약 21.3℃의 온도를 유지하는데, 이때 봉구를 형성하여 열 손실을 최소화하고 (Southwick, 1985) 근육을 떨어 열을 발생한다 (Stabentheiner et al., 2010). 외부 온도의 변화가 심하면 봉구의 수축과 이완의 반복이 증가하여 월동을 위한 열 유지에 어려움을 겪게 된다 (Fahrenholz et al., 1989). 외국의 실외 월동 봉군 폐사율이 약 8~22%로 보고된 바 있으며 (Pederson et al., 1996), 국내에서도 지역별 차이가 있었으나 10~15%의 월동기 폐사율이 조사되었다 (최 등, 1999). 실내 월동 봉군의 폐사율은 실외 월동 봉군의 폐사율보다 약 10%가 낮은 것으로 확인되었지만 항온 조절 장치 없이 2~9℃ 사이를 오가는 실내에서 수행된 결과였다 (최 등, 1999). 본 연구에서는 항온 조절 장치가 있는 실내 저온 창고를 이용하였고 1℃ 및 4℃에서 월동한 봉군의 무게 변화율을 비교한 결과 각각 13.19%, 10.71%로 4℃의 항온 저온 창고에서 월동한 봉군의 무게 감소율이 1℃의 그것보다 낮은 것을 토대로 4℃ 항온 저온 창고 월동 효율이 더 좋은 것으로 판단하였다. 또한 1℃ 항온 저온 창고에서 월동한 봉군의 무게 감소율 (13.19%)은 야외 월동 봉군의 무게 감소율 (국립농업과학원: 14.63%, 위도 꿀벌격리육종장: 13.93%)보다 각각 1.44%, 0.74% 낮음을 보이며 야외 월동이 실내 월동보다 월동 효율은 적으나 1℃ 이하의 저온 월동은 무의미할 것으로 판단된다.

곤충은 내제 면역계 (Innate immune system)와 적응 면역계 (Adaptive immune system) 모두를 가지고 있는 고등 척추동물과 달리 내제 면역계만을 보유하고 있다 (Reviewed by Larsen et al., 2019). 곤충의 외피층을 이용한 물리적 장벽을 포함하는 내제 면역 시스템 (Innate immune system)은 세포성 (Cellular) 면역 시스템과 체액성 (Humoral) 면역 시스템으로 구성되며 외부 병원균, 곰팡이, 바이러스, 화학물질 등에 대응한다. 꿀벌은 초파리 및 학질모기와 유사한 면역 시스템을 가지고 있으나, 약 2/3 정도 적은 수준의 면역 유전자 개수를 보이며, 이는 사회성에 의한 사회적 방어 (Social difense) 때문으로 추측된다 (Cremer et al., 2007). 꿀벌 면역과 관련된 대표 유전자들의 월동기간 중 발현 변화를 조사한 결과 세포성 면역 시스템의 하나인 melanization을 조절하는 PPO 유전자 (Lu et al., 2014)와 활성산소 (Reactive oxygen species; ROS)에 의한 산화 피해를 줄이는데 일차 항산화 효소 (Primary antioxidant enzyme)로 기능하는 Sod와 Catalase 유전자 (Corona and Robinson, 2006; Heck et al., 2010; Buettner, 2011)의 발현은 지속적으로 억제가 되었으며 설탕물 및 대용화분 공급으로 월동이 종료된 이후 3월 중순에 재발현됨을 확인하였다 (Fig. 2). 이는 기온 감소에 따른 월동의 시작으로 꿀벌 대사의 대부분이 억제되었기 때문으로 예측되며 3월 봄의 시작으로 월동이 종료됨에 따라 활동을 재개하며 그 발현이 증가한 것으로 생각된다. 이와 유사하게 꿀벌의 체액성 면역을 담당하는 항균성 펩타이드 (Antimicrobial peptide; AMPs) 중 Def1을 제외한 Def2, hymenoptaecin, abaecin, apidaecin 유전자 모두의 발현이 월동 중 억제되었고 월동에 깨어나는 3월에 발현이 재개되었으며 월동에 의한 꿀벌 대사의 억제 및 재개에 따른 결과로 추측된다. 하지만 Def1 유전자의 경우 월동이 시작되면 점차적으로 발현이 증가하다가 월동이 끝나는 시점에서 발현이 급격히 억제되며 다른 AMPs와 반대되는 발현 패턴을 보였다. Def1은 꿀벌의 턱밑샘 (Mandibular gland)와 침샘 (Salivary gland)에서 합성되고 (Lopez et al., 2003; Klaudiny et al., 2005) 꿀과 로열젤리로 분비되어 (Qu et al., 2008; Kwakman et al., 2010) 봉군의 단체 면역 (Social immunity) 형성에 관여하는 반면 Def2는 지방체 (Fat body)의 지방세포 (Adipocyte)와 혈림프 (Hemolymph)에서 합성되어 개별 면역 (Individual immunity)에 관여한다 (Casteels et al., 1989; Klaudiny et al., 2005). 월동기 생체 활성의 억제로 Def2를 포함한 대부분의 AMPs 유전자의 발현은 억제되었지만, 봉군 유지를 위한 최소한의 면역 시스템으로 봉군에 보관중인 꿀을 먹으며 꿀에 포함되어있는 Def1을 이용 및 합성하기 때문에 월동 중 Def1 유전자의 발현이 유지되는 것으로 생각된다.

항온 저온 창고를 이용한 실내 월동의 결과 창고의 온도에 의한 꿀벌 면역 관련 유전자의 발현에 유의미한 차이가 확인되지는 않았으나, 개체별 면역에 관여하는 면역은 억제되고 봉군 전체를 위한 사회성 면역 시스템에 관여하는 Def1이 꿀벌의 월동에 매우 중요하게 작용하는 것으로 판단된다.

본 실험에 사용된 mfe 유전자는 대부분의 곤충 juvenile hormone (JH) 생합성의 마지막 단계인 methyl farnesoate의 산화를 촉매하는 효소의 역할을 하고 (Helvig et al., 2004; Claudianos et al., 2006), 꿀벌 mfe 유전자의 발현과 JH 발현양의 양의 상관관계로 mfe 유전자의 발현이 JH의 발현양을 나타내는 지표로 사용할 수 있기 때문에 (Bomtorin et al., 2014) 월동기간 중 일벌의 JH 발현양 파악을 위한 유전자로 mfe를 사용하였다.

Vg와 JH은 상호작용하여 산란, 계급 분화 (Labor division), 수명 등 꿀벌의 다양한 생리 조절에 관여한다 (Amdam et al., 2003a; Amdam et al., 2003b; Amdam et al., 2004; Corona et al., 2007; Nelson et al., 2007; Ament et al., 2008). 일벌에서 탈피 2주 미만의 내역봉은 높은 Vg, 이후의 외역봉은 낮은 Vg의 발현을 보이고 JH는 Vg와 반대로 발현되며 음의 상관관계를 보인다 (Hartfelder and Engels, 1998). 또한 Vg 단백질의 발현이 늦가을과 초겨울에 높고, 늦겨울에 낮은 기존의 실험 결과 (Fluri et al., 1977; Huang and Robinson, 1995)와 유사하게 본 실험에서 Vg 유전자는 월동기간 상대적으로 높은 발현을 보였고 월동이 끝나는 시점에 그 발현이 억제되었다. 반대로 JH 유전자는 월동기간 발현이 억제되었고, 월동이 끝나는 시점에 발현이 재개되었는데, 이는 약 3~4개월의 월동 기간을 버텨야하는 월동 벌 수명의 장기화와 연관된 것으로 짐작된다.