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실험에 재료로 사용된 프로폴리스는 대한민국 충북 지역의 양봉농가에서 제공받은 원괴 100 g에 1 L의 80% 에탄올을 첨가하여 48시간 동안 실온에서 교반하며 추출하였다. 추출물은 miracloth로 1차 여과한 다음, Whatman No. 2 필터로 2차 여과하여 불순물을 제거하였다. 이후 감압농축 장치에서 완전히 농축시켰고, 100 mg/mL의 농도가 되도록 에탄올을 첨가하여 완전히 용해시켰다. 세포에 처리하기 위해 synringe filter에 여과하여 사용 시까지 냉장 보관하였다.

PC-12 세포 배양을 위한 RPMI-1640, penicillin-streptomycin, horse serum은 Gibco사의 배지를 사용하였으며, fetal bovine serum (FBS)은 GenDEPOT (Korea)사에서 구입하여 사용하였다. Serum은 배지에 첨가하기 전 56℃에서 50분간 불활성화하였다. 세포에 소포체 스트레스를 유발하는 tunicamycin은 Sigma (USA)사에서 구입하였고, 세포 독성 평가를 위한 EZ-Cytox solution은 두젠바이오 (Korea)사의 제품을 사용하였다. Western blotting에 사용된 tau, GAPDH, GSK-3α, GSK-3β, Akt 그리고 ERK 항체는 Santacruz (USA) 것을 사용하였으며, phospho-tau (Ser46, Ser214, Ser416 그리고 Thr 205), phospho-Akt (Ser473)은 Cell signaling (USA) 것을 사용하였다.

실험에 사용한 PC-12 세포는 한국세포주은행에서 보관 중인 세포를 구입하여 사용하였다. 세포 배양은 RPMI-1640 배지에 100 unit/mL의 penicillin-streptomycin, 15% horse serum과 5%의 FBS를 첨가하여 사용하였다. 세포는 37℃, 5%의 CO₂가 공급되는 배양기에서 배양하였다.

세포 생존에 대한 프로폴리스와 tunicamycin의 독성을 평가하기 위해 EZ-cytox MTT 평가법을 이용하였다. PC-12 세포를 96-well plate에 2×10⁴ cells/well이 되도록 분주한 뒤, 24시간 동안 배양시켰다. 배양된 세포에 프로폴리스 추출물과 tunicamycin을 농도 의존적으로 처리하였는데, 처리 농도는 다음과 같다.

Propolis : 1, 10, 50, 100, 250, 500 그리고 1,000 μg/mL

Tunicamycin : 0.1, 1, 5, 10, 25, 50, 100 그리고 150 μg/mL

이때, 프로폴리스와 tunicamycin의 대조군으로서 아무것도 처리하지 않고 배지만을 포함시킨 그룹과 프로폴리스와 tunicamycin을 용해하는 데 사용된 에탄올과 dimethylsulfoxide (DMSO)를 용매 대조군으로 설정하였다. 프로폴리스와 tunicamycin을 처리하고 24시간 후에 EZ-cytox 용액을 배지 부피의 1/10로 처리한 후 2시간 동안 반응시켰고, 250 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Tunicamycin과 프로폴리스에 의한 세포 내 단백질 변화를 확인하기 위해, 6-well plate에 2×10⁵의 세포를 접종하고, 24시간 후에 프로폴리스와 tunicamycin을 세포 독성 평가 실험과 같은 농도로 처리하였다. 이때 처리 조건을 다음과 같이 설정하였다.

세포에 프로폴리스 추출물과 tunicamycin을 처리하고 세포에서 단백질을 회수하기 전에 세포의 형태 변화를 EVOS XL core 현미경 (Thermo, USA)으로 촬영하여 세포 독성 결과와 비교하였다. 프로폴리스와 tunicamycin이 처리된 세포를 1× phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 2회 수세한 뒤, 200 μL의 NP-40 lysis buffer (Invitrogen, USA)를 첨가하고 cell scraper를 이용하여 세포를 용해시켜 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 17,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 pellet을 제거하고 상층액만을 회수하였다. 회수된 세포 추출물은 bicinchronic acid (BCA) 단백질 정량법으로 농도를 측정하였으며, Western blotting에는 20 μg의 단백질을 사용하였다. 5× SDS sample buffer (250 mM Tris-HCl (pH 6.8), 5% 2-Mercaptoethanol, 10% SDS, 0.5% Bromophenol blue, 50% Glycerol)를 혼합한 뒤, 100℃에서 10분간 변성시켰으며, 이를 12% polyacrylamide gel에 loading하여 전기영동하였다. 전개된 단백질은 transblot 장치 (Bio-Rad, USA)에서 7분간 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 transfer한 다음, 2% non-fat dry milk로 실온에서 1시간 동안 반응시켜 항체의 비특이적 반응을 차단하였다. 1차 항체로 사용된 tau, GSK-3α, GSK-3β, Akt, ERK, phospho-Tau, phospho-Akt 항체는 1 : 1,000으로 2% non-fat dry milk에 희석하였으며, GAPDH는 1 : 5,000으로 2% non-fat dry milk에 희석하였다. 1차 항체 반응은 실온에서 16시간 동안 반응시켰고, 항체 반응 후 1× tris-buffered saline tween-20 (TBS-T) 용액으로 수세 후, 1차 항체의 host에 맞춰 2차 항체인 goat anti-mouse-HRP 또는 goat anti-rabbit-HRP를 1 : 2,000으로 5% non-fat dry milk에 희석하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 2차 항체 반응 후, TBS-T 용액으로 10분간 3회 수세 후, ECL pico detection system (GenDEPOT, Korea)으로 발색 후, ChemiDOC (Bio-RAD, USA) 장치에서 검출하였다.

Fig. 1. 
Propolis and tunicamycin treatment condition.

실험을 통해 얻어진 결과의 통계 유의성은 R (3.4.1 version, New Zealand) 통계 프로그램을 이용하였으며, 실험상의 평균 유의성은 ANOVA 검정으로 p<0.05에서 검증하였다.

총 3회에 걸쳐 추출한 프로폴리스 추출물의 수율을 분석한 결과, 1차 38.4%, 2차 42.7% 그리고 3차 37.2%의 수율을 나타냈으며, 실험에 재료로 사용된 프로폴리스는 평균 39.4%로 추출되었음을 확인하였다.

PC-12 세포주에서 나타내는 프로폴리스 추출물과 tunicamycin의 세포 독성을 MTT assay를 응용한 EZ-cytox detection system으로 확인하였다. Fig. 2A에서 나타난 것처럼 프로폴리스 추출물은 50 μg/mL의 농도에서 lethal dose (LD) 50을 나타냈으며, Fig. 2B에서 나타난 것처럼 tunicamycin의 경우 150 μg/mL의 농도에서 약 50%의 세포 생존율을 나타냈다. 본 실험에서는 프로폴리스 추출물은 10 μg/mL의 농도로 설정하고 tunicamycin은 150 μg/mL의 농도로 설정하여 다음 실험에 적용하였다.

Fig. 2. 
Cytotoxicity of propolis extracts and tunicamycin. Propolis extracts and tunicamycin treated on dose-dependent manner. Propolis extracts and tunicamycin incubated for 24 hrs.

세포 독성 농도의 결정에 따라 프로폴리스 추출물과 tunicamycin을 처리한 후 세포의 형태를 확인하였다. 앞서 재료 및 방법에서 서술한 Western blotting의 실험 조건에 따라 프로폴리스 추출물과 tunicamycin을 처리한 후, EVOS XL-core 현미경으로 세포의 변화된 형태를 촬영하였다. Fig. 3에서 보는 것과 같이 프로폴리스 추출물만을 처리한 실험군에서는 세포의 사멸이 확인되지 않았으며, tunciamycin만을 처리한 실험군에서는 대부분의 세포가 세포사멸 단계에 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 프로폴리스를 전처리하고 tunicamycin을 후처리한 실험군에서는 사멸하는 세포가 적은 것이 확인되었는데, 이는 프로폴리스 추출물이 세포를 보호하는 것을 의미한다. 반대로 tunicamycin을 전처리하고 프로폴리스 추출물을 후처리한 실험군에서는 일부 정상적인 세포가 확인되었다. 프로폴리스 추출물과 tunicamycin을 동시처리한 실험군에서는 tunicamycin을 전처리한 세포보다 생존해 있는 세포가 더 많은 것을 볼 수 있다. 이는 프로폴리스 추출물이 tunicamycin의 독성으로부터 세포를 보호하고 있음을 의미하는 것이다.

Fig. 3. 
Propolis extracts protect the cells from tunicamycin toxicity. Propolis extracts and tunicamycin was treated for 24 hrs. Propolis extracts and tunicamycin pretreatment for 12 hrs, then tunicamycin and propolis extracts were treated for 12 hrs.

PC-12 세포에 tunicamycin과 프로폴리스 추출물을 처리함으로써 세포 내 tau 단백질의 과인산화 변화를 확인하였다. 프로폴리스 추출물과 tunicamycin을 처리한 후, 단백질을 회수하여 tau 항체와 phospho-tau 항체로 blotting하여 결과를 확인하였다. Fig. 4A에서 나타난 것처럼 tau 항체로 blotting한 결과에서 보면 tunicamcyin을 처리한 실험군에서 tau의 분자량 위치에서 band가 shift된 현상을 확인할 수 있다. 이는 tunicamycin을 처리한 세포가 ER-stress를 받음으로써 tau 단백질이 세포 내에서 과인산화되어 분자량이 상승한 것이다. 그런데 프로폴리스를 먼저 처리하고 tunicamycin을 나중 처리한 실험군에서는 shift된 band가 약해진 것을 확인할 수 있었다. 이는 프로폴리스가 전처리되면서 세포를 보호하는 역할을 하고 이후 tunicamycin이 처리되어도 세포에 ER-stress를 일으키지 않는 것으로 생각된다. 반대로 tunicamycin을 전처리하고 프로폴리스 추출물을 후처리했을 때와 tunicamycin과 프로폴리스 추출물을 동시에 처리한 실험군에서는 shift된 band가 약해지긴 하지만 프로폴리스 추출물을 전처리한 실험군보다 효과는 크지 않았다. 즉, 프로폴리스 추출물이 ER-stress가 이미 발생된 세포에서는 효과가 나타나지만 프로폴리스 추출물이 전처리된 세포에서보다는 효과가 적은 것을 의미한다. 이는 프로폴리스 추출물이 치료적인 효과보다는 예방적인 효과가 뛰어난 것을 뜻하며, 건강기능식품으로 프로폴리스 추출물을 사용하는 것이 더 적절하다는 것을 의미할 수 있다.

Fig. 4. 
Propolis inhibits tau hyperphosphorylation by ER-stress. 20 μg of protein lysates were used in this experiments. Primary antibody were incubated for 16 hrs at room temperature. Each antibody were diluted in 2% skim milk at 1 : 1,000.

Tau의 과인산화에서 어떤 아미노산이 결정적인 역할을 하는지를 확인하기 위해 phospho-tau 항체로 blotting하여 결과를 확인하였다. Phospho-tau 항체의 표적 아미노산은 46번 세린, 205번 트레오닌, 214번 세린, 416번 세린 잔기이다. Fig. 4B에서 보는 것과 같이 tunicamycin에 의해 tau가 과인산화되는데, 이때 46번, 214번, 416번 세린 잔기들은 모두 인산화가 증가된 것으로 나타났고, 반대로 205번 트레오닌 잔기의 경우 tunicamycin을 처리한 실험구에서 오히려 감소되었다. 이는 ER-stress가 발생할 경우 tau의 과인산화의 주된 잔기가 세린이라는 것을 의미하며, 세린 잔기가 과인산화되면서 세포 내 tau의 응집 현상에 영향을 주게 되며, 반대로 트레오닌이 tunicamycin에 의해 감소되는 것은 tau의 과인산화에서 트레오닌 잔기 역시 영향을 미치고 있다는 것을 의미한다. 즉, 세린과 트레오닌 잔기가 서로 반대로 인산화되면서 tau의 세포 내 응집에 역할을 부여하고 있는 것으로 생각할 수 있다. 프로폴리스 추출물을 전처리했을 때는, 세린 잔기의 인산화가 감소하고 트레오닌 잔기의 인산화는 증가하는 것으로 확인되었다. 즉, ER-stress에 의해 tau가 과인산화되면서 세포 내 tau의 응집이 발생하고, 이는 노인성치매 (AD)의 발병에 중요한 요소가 되는데 프로폴리스 추출물이 이를 해소할 수 있는 것을 의미한다. 본 결과를 통해 AD의 발병과 진행에서 tau 과인산화가 중요하며, tau내 46번, 214번, 416번 세린 잔기의 과인산화 및 205번 트레오닌 잔기의 인산화 감소가 결정적인 역할을 하는 것으로 확인되었다. 그리고 프로폴리스 추출물이 이를 방지함으로써 AD의 발병 및 진행을 늦출 수 있다는 것을 의미한다.

프로폴리스 추출물과 tunicamycin에 의한 tau 인산화와 관련된 신호 단백질의 변화를 확인하기 위해 tau 신호 과정에 있는 단백질의 발현을 Western blotting으로 확인하였다. Tau 신호 전달 과정에서의 주요 단백질은 Akt, GSK-3α, GSK-3β 그리고 ERK 등이 있다. Fig. 5에서 보는 것과 같이 Akt의 경우 tunicamycin을 처리하면 인산화된 단백질의 band가 약해진 것을 확인하였다. 그러나 프로폴리스 추출물을 처리하면 인산화 band가 변화되는 것을 확인할 수 있으며, 프로폴리스 추출물을 전처리할 경우 Akt의 인산화를 본래대로 회복시켰다. 반대로 tunicamycin을 전처리했을 경우 tunicamycin을 단독처리했을 때보다는 인산화 band가 강해졌으나 프로폴리스 추출물을 전처리했을 때보다는 효과가 적었다. Akt의 인산화에서 핵심적인 잔기로 알려진 473번 세린의 인산화 항체로 blotting한 결과 프로폴리스 추출물에 의해 473번 잔기의 인산화가 회복되고 있음을 알 수 있다. 즉, tunicamycin에 의한 ER-stress 발생 시 tau의 신호 경로에 있는 단백질의 발현 및 인산화에도 프로폴리스 추출물이 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다. 또한 GSK-3α와 GSK-3β의 경우에도 프로폴리스 추출물이 단백질의 발현에 영향을 주고 있음을 알 수 있다. GSK-3의 경우에는 ER-stress 발생 시 활성화되는 단백질이다. 이 활성화를 프로폴리스 추출물이 억제시키면서 정상적인 신호 경로로 회복될 수 있도록 조정하는 것을 의미한다. 그러나 또 다른 주요 단백질인 ERK의 경우에는 단백질 발현 자체에는 큰 영향을 나타내지 않았다.

Fig. 5. 
Propolis extracts recovered tau signaling-related protein expression. 20 μg of cell lysates were used in Western blotting. Each antibody were diluted in 2% skim milk at 1 : 1,000 except GAPDH. GAPDH was diluted at 1 : 5,000. GAPDH was housekeeping control for Western blotting.

AD는 현재까지도 발병을 늦추거나 치료할 수 있는 약제가 없는 대표적인 신경퇴행성 질환이다. 현대 사회의 고령화를 고려했을 때, 앞으로 사회는 AD 환자가 늘어날 것으로 전망되며, AD의 발병을 늦출 수 있거나 치료할 수 있는 약제의 개발이 시급한 상황이다. 본 연구에서는 꿀벌의 대표적인 산물인 프로폴리스를 이용하여 AD의 주요 마커인 tau의 과인산화를 저해할 수 있는 분자생물학적 실험 결과를 제시하였다. 인위적인 합성 약제가 아닌 천연물 그대로의 프로폴리스를 이용함으로써 부작용없이 안전하게 AD를 예방할 수 있는 근거를 보여주고 있다. 본 연구를 바탕으로 향후 더욱 세밀한 분자적 기전을 구명함으로써 AD의 예방에 대한 확실한 기준을 마련할 것으로 생각되며, AD 예방에 대한 프로폴리스 성분에 대한 추가적인 연구가 더 필요할 것으로 생각된다.