황칠나무 꽃의 곤충 방화, 화밀의 분비 특성과 당 함량 및 아미노산 분석

공시재료

전라남도 광양시 광양읍 우산공원에 조성된 황칠나무를 대상으로 실시하였다. 공시 수종의 수령은 15년, 수고는 평균 4.5m, 흉고직경은 평균 14.5cm로 정상적으로 생육한 황칠나무 3본을 조사목으로 선정하였다.

개화량 및 곤충 방화 조사

황칠나무의 개화량 조사는 공시목을 대상으로 개화 시작일로부터 종료일까지 4방위에서 조사하였다. 화아발생부터 개화종료까지의 방위별 2개씩 총 24개의 개화지에서 조사일마다 개화된 수를 조사하여 개화율을 나타냈다.

곤충 방화 조사는 조사 적정시기에 08시부터 16시까지 1시간 간격으로 조사를 실시하였으며, 6개의 개화지에서 각각 10분 동안 조사하였고 선정된 개화지의 송이에 방문하여 채밀활동을 한 꿀벌(Apis mellifefa)을 포함한 수분매개자를 동정하고 방문한 수를 조사하여 각 개화지에서 한 시간 동안의 곤충 방화 수를 추정하였다.

화밀 분비량 조사 및 수집

수분매개자에 의한 화밀의 손실을 방지하기 위해 조사 1일 전에 교배봉투를 꽃차례에 씌웠으며, 황칠나무 꽃에서 화밀이 분비하는 패턴을 분석하기 위해서, 8월 15일부터 8월 17일까지 3일 동안 조사하였다. 본 당 20개 이상의 꽃을 대상으로 오전 10시와 오후 4시에 3μl capillary tube(Drummond, USA)를 이용하여 선정된 꽃에서 이틀 동안 4회를 채취하였다. 꽃의 생리적 특성상 수정이 될 때까지 화밀이 분비되기 때문에 4회 채취를 기준으로 하였다. 화밀 분비 시작 시점이 다른 2가지 시점(15~16일, 16~17일)에 대해서 총 화밀량과 건조화밀량을 분석하였고 건조화밀량은 화밀을 채취한 후에 3μl capillary tube를 오븐기(FO-600M, JEIO TECH, Korea)에서 80°C로 24시간 건조 후 남은 화밀량을 조사하였으며, 각각 조사된 시점에 건조화밀량과 함수율을 조사하였다. 조사과정 중 탈락된 꽃 및 오염된 꽃은 실험의 정확성을 위해 시점별 분비패턴 조사에서 제외시켰다.

또한, 유리당과 유리아미노산 분석을 위해서, 500μl microliter syringe(Hamilton, USA)를 이용하여 화밀을 수집하고 채취한 양을 기록한 후 꽃 하나의 화밀량을 추정하였으며 휴대용당도계(GMK-703T, Korea)를 이용하여 화밀 당도를 측정하였다. HPLC 분석 전까지 화밀을 0.45μm membrane filter에 필터링 한 후 80% 알코올을 채워 Eppendorf vial에 수집한 화밀을 고정한 다음 초저온냉동고(-70°C)에 보관하였다.

유리당 함량 분석

수집된 화밀 시료를 0.45μm syringe filter(Millipore, Billerica, MA, USA)로 여과하여 HPLC(Dionex ultimate 3000, Dionex, USA)를 이용하여 분석하였다. 이동상으로는 3차 증류수를 사용하였고, 유속은 0.5ml/min 으로 하였으며, 오븐 온도는 80°C로 설정하였다. Shodex Ri-101 detector(Japan)로 검출하였으며, Aminex 87P column(300mm×7.8mm/Bio-rad, USA)을 사용하였다. 함량은 적분계에 의한 외부표준법으로 계산하였으며, 표준품으로는 Sucrose, Glucose, Fructose(Sigma, USA)을 사용하였다.

유리아미노산 분석

채취된 화밀 시료의 아미노산을 O-phthalaldehyd(OPA)-Fluorenylmethyl chloroformate(FMOC) 유도체화하여 분석하였다. Borate buffer, OPA/Mercaptopropionic acid(MPA), FMOC 시약에 시료를 단계적으로 혼합한 다음, 0.45μm syringe filter (Millipore, Billerica, MA, USA)로 여과하여 HPLC(1200 series, Aglient, USA)를 이용하여 분석하였다. 이동상은 10mM Na₂HPO₄, 10mM Na₂B₄O₇·10H₂O가 포함된 A용액(pH 8.2)과 Water: Acetonitrile:Me thanol=10:45:45로 혼합된 B용액에 대하여 A용액:B용액으로 초기 100:0(v/v, %)에서 26~28분에 55:45, 28~30.5분에 0:100, 30.5분부터는 100:0으로 구배 조건을 설정하였다. 유속은 1.5ml/min으로 하였고 주입량은 1ml 설정하였으며 컬럼 온도는 40°C로 설정하여 Inno C18 column (Innopia, Korea, 4.6mm×150mm, 5μm)을 사용하였다. 검출기는 자외선 검출기와 형광 검출기를 연결시켜, 자외선은 338nm에서, OPA유도체는 방출 파장은 450nm, 여기 파장은 340nm, FMOC유도체의 방출 파장은 305nm, 여기 파장은 266nm에서 검출하였다.

Fig. 1.

Pictures of D. morbifera shape and flowers.

개화량 및 곤충 방화 분석

2014년 광양시 광양읍 우산리에 식재된 황칠나무의 전체 개화는 8월 8일부터 8월 31일까지 약 23일간 지속되었다. 본 연구 조사목의 개화는 8월 8일부터 8월 22일까지 15일간 지속되었으며 8월 15일에서 17일까지 화밀 특성 조사를 실시하였고 16일에 곤충방화 조사를 실시하였다(Fig. 2). 황칠나무는 꽃 송이 주변부에서 하나씩 개화하는 특성을 가지고 있고, 조사시기가 장마기간과 겹치기 때문에 조사할 수 있는 꽃수를 확보하기 위해서 개화기간 초기에 조사를 실시하였다.

황칠나무의 꽃을 방문하는 곤충들은 꿀벌(Apis mellifera), 호박벌(Bombus ignitus), 말벌과(Vespidae), 꽃등에과(Syrphidae) 등이 방문하였으며 주로 꿀벌과 말벌류의 방문이 많았다. 조사 시점에 하나의 개화지에서 시간대별 꿀벌과 기타 방화곤충의 방화수를 조사한 결과는 다음과 같다(Fig. 3).

8월 16일 하루 동안 개화지 하나에서 방문한 꿀벌은 47.3마리, 기타 수분매개자는 21.8마리로 추정되었으며, 꿀벌의 최대 방화시간은 13시와 14시 사이였다. 이와 동일한 방법으로 조사된 아까시나무의 하루 동안 송이 당 꿀벌 방화수는 372마리, 피나무, 찰피나무, 섬피나무는 각각 458마리, 488마리, 290마리, 광나무는 220마리, 때죽나무는 160마리 등으로 보고되고 있어(한 등, 2009; Han et al., 2010; 김 등, 2013; 김 등, 2014b; Kim et al., 2015), 황칠나무는 보고된 수종들과 비교하여 상대적으로 꿀벌 방화수가 적은 것으로 나타났다.

하지만 방화곤충 중에서 벌꿀 생산에 직접적으로 연관된 꿀벌의 방화수가 69%의 가장 높은 비율로 나타났으며, 말벌과(Vespidae), 꽃등에과(Syrphidae), 호박벌(B. ignitus), 기타 방화곤충 순서로 방문 비율이 높게 나타났다(Fig. 4). 황칠나무의 개화시기는 대부분 우기와 겹치고, 다른 수종과 달리 본 조사 시점에서 상대적으로 적은 방화곤충들이 관찰되었다. 수종별 방화곤충의 비교는 지리적, 기후적인 요인 등에 의해서 직접 비교는 어려우나, 해당 수종의 꿀벌의 선호도를 파악하여 밀원 수종의 가능성을 간접적으로 판단할 수 있었다.

Fig. 2.

Flowering rate of D. morbifera.

Fig. 3.

Visited number of pollinators on flowering lateral bunch of D. morbifera.

Fig. 4.

Picture of major pollinators and ratio of visited pollinators on flowering lateral bunch of D. morbifera.

화밀 분비 특성

3일 동안 화밀분비량을 조사하였으며 황칠나무 꽃 하나에서 2일 동안 시간대별로 화밀 분비 패턴을 나타낸 결과는 Table 1과같다.

대부분 밀원수종의 화밀 분비는 오전 시간대에 많이 분비되는 것으로 알려져 있으나(Kim et al., 2011; Kim et al., 2012; 김 등, 2013; 김 등, 2014b), 황칠나무 꽃의 이틀 동안 화밀 분비는 시간대와 개화 시점에 따라 일정한 패턴을 보이지 않았다.

8월 15일에 개화가 시작한 꽃에서 꽃 하나 당 이틀 동안 분비되는 총 화밀량은 4.03μl를 나타냈으며, 8월 16일에 개화가 시작한 꽃에서는 4.99μl를 나타내어 꽃 하나 당 평균 4.5μl가 분비됨을 알 수 있었다. 같은 방법으로 조사를 실시했던 수원 지역 15년생인 섬피나무와 중국 산사나무 꽃의 총 화밀량인 12μl와 13.8μl의 결과와 10년생 찰피나무의 총 화밀량인 18.4μl의 결과를 비교하였을 때 상대적으로 적은 화밀 분비량을 나타냈다(Han et al., 2010; Kim et al., 2011; 김 등, 2013). 총 화밀량은 환경적, 기후적인 요인과 꽃의 형태학적 특성에 따라서 영향을 많이 받기 때문에 수종 간의 비교는 상당히 어렵다. 하지만 화밀 내 수분함량 및 당 함량 등이 수분매개자들의 화밀 섭식에 영향을 주기 때문에 밀원수종으로의 가능성을 판단하기 위해서는 화밀분비량 조사는 필요하다(Pacini et al., 2003).

또한, 총 화밀량에서 함수율은 평균 88.1%를 나타냈으며, 황칠나무 꽃의 건조 화밀량은 각각 0.40μl와 0.55μl로 나타나 꽃 하나당 평균 0.48μl의 건조 화밀량이 분비됨을 알 수 있었다. 이 결과도 피나무 2.0μl, 섬피나무 1.0μl의 결과와 비교하였을 때 적은 건조 화밀량을 나타냈다. Nepi and Stpiczynsk(2007)에 의하면 식물체는 환경변화에 따라 화밀농도의 항상성을 유지하도록 하며 그 이유는 생태적으로 수분매개자를 유인하고, 당의 농도를 조절하여 식물체에 대한 에너지 균형을 유지하기 위함이라고 보고된 바 있다. 따라서 밀원수종의 선발 또는 개체 선발을 위해서는 기상인자에 영향을 많이 받는 총 화밀량보다는 조금 덜 받는 건조화밀량과 꽃 하나 당 유리당 함량이 주요 판단인자가 되어야 한다(Kim et al., 2012).

Table 1.

Pattern of secreted nectar volume of total and dry nectar per flower during the 2 days (unit: ul)

화밀 유리당 함량 및 꿀의 양 추정

8월 16일부터 17일까지 Microliter syringe, 휴대용 당도계와 HPLC에 의해 조사된 황칠나무의 꽃 하나 당화밀량과 당도 그리고 화밀 내 유리당 함량을 분석한 결과는 Table 2와 같다. 16일 17시에는 60개의 꽃에서 240μl를 수집하여 꽃 하나당 4.0μl의 화밀량을 추정하였고 수집한 화밀의 화밀농도는 23.6%를 나타냈다. 17일 10시와 17시에는 각각 꽃 하나 당 2.4μl와 2.1μl의 화밀량을 추정하였고 화밀 농도는 각각 16.0%, 23.2%를 나타냈다.

단위 용량 당 유리당 함량은 화밀을 수집한 3시점에서 큰 차이를 보이지 않았으며, 평균적으로 27.8μg/μl의 유리당 함량을 산출할 수 있었다. Microliter syringe로 화밀을 수집하여 추정된 꽃 하나당 화밀분비량과 HPLC에 의해 분석된 단위용량 당 유리당 함량을 곱해주면 8월 16일 17시에는 116.3μg, 17일 10시와 17시에는 각각 61.0μg으로 나타났으며 평균적으로 79.4μg의 꽃 하나 당 당함량을 산출할 수 있었다. 이와 동일한 방법으로 조사된 쉬나무는 수꽃이 48.0μg, 암꽃이 37.8μg을 나타내어 그 결과와 비교했을 때 황칠나무 꽃에서 상대적으로 많은 꽃 하나 당 당함량이 산출되었으며, 때죽나무의 꽃 하나 당 당함량 71.0μg과 비교했을 때 상대적으로 적은 꽃 하나 당 당함량이 산출되었다(김 등, 2014a; Kim et al., 2015). 이와 같은 결과는 기후적, 식물 생리학적인 종 또는 개체 특이적인 요인에 의해 크게 영향을 받을 수 있기 때문에 직접 비교는 어렵지만 간접적으로 수종별로 꽃 하나 당 당함량을 산출하여 비교할 수 있었다.

Petanidou(2003)는 화밀 당량에서 비례식(85:100)을 통하여 꿀의 양을 추정할 수 있다고 하였고, 화밀 당량이 85% 이상 농축되면 꿀의 레벨로 도달한다고 하였다. 이러한 결과를 토대로 황칠나무 꽃 하나당 93.4μg의 꿀 수확량을 추정할 수 있었다. 이러한 결과는 꽃 하나에서 1회 채취한 결과이기 때문에 최소한의 꿀 수확량을 나타낸 것이다. 화밀은 수정이 이루어질 때까지 계속적으로 분비되며 그 시기에 꿀벌의 섭식은 한 번 이상 이루어지므로 본 연구 결과보다 더 많은 꿀의 양을 수확할 수 있다. 또한 꿀이 만들어지는 것은 꿀벌의 소화생식과 연관이 있지만 개략적으로 꿀의 양을 추정하였고, 우리나라에서 생육하는 밀원식물을 대상으로 화밀 특성에 의한 꿀의 양을 추정하기 위한 추정식 개발 연구가 필요하다고 판단된다.

Table 2.

Nectar composition and estimated sugar contents and honey production based on nectar characteristics in the floral nectar of D. morbifera

아미노산 함량비 분석

황칠나무 꽃의 3 시점에 대한 화밀의 아미노산의 함량비를 분석한 결과는Table 3과같다.

황칠나무 화밀에서는 Phenylalanine, Glutamine, Proline 순으로 많은 함량이 검출되었고 이들의 함량이 전체 아미노산의 83%를 차지하였으며, 특히 Phenylalanine의 함량비가 67.2%로 특이적으로 높은 결과를 나타냈다. 또한 Methionine, Tryptophan, Lysine, Hydroproline 등 4종의 아미노산은 검출되지 않았다. GABA(Gamma aminobutyric acid)와 Phenylalanine은 지중해 지역 대부분 식물의 화밀 아미노산 중 꿀벌과와 가위벌과의 선호도에 큰 비중을 차지하는 것으로 알려져 있으며(Petanidou et al., 2006), 본 연구에서는 GABA가 평균 0.6% 함량비를 나타냈고, Phenylalanine은 가장 많은 함량비를 나타낸 반면, 국내의 결과 중에서 쉬나무 수꽃과 암꽃 화밀에서는 Phenylalanine이 검출되지 않았으며, 때죽나무 화밀의 경우 1.0%를 차지한 결과와 비교하였을 때 다소 특이적이라고 할 수 있다(김 등, 2014a; Kim et al., 2015). 이 결과는 수종 특성 및 환경적, 지리적인 차이로 인하여 아미노산 구성에 차이가 있다고 판단된다. 아미노산은 수분매개자들에게 화밀의 맛을 결정하는 중요한 역할을 하기 때문에 황칠나무 화밀의 아미노산 조성 차이로 인해서 꿀벌 방화에 영향을 미친다고 판단된다. 아미노산의 함량 차이는 기후적, 환경적인 영향을 받기 때문에 밀원수의 정확한 가능성 판단을 위해서는 아미노산 함량에 따른 꿀벌의 섭식 행동에 관한 연구를 지속적으로 수행해야 할 것이다.

Table 3.

Amino acids on nectar in flower of D. morbifera